專利名稱：一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種骨軟骨生物修復復合材料及其制備方法和應用，具體涉及一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架及其制備方法和應用。
背景技術：
隨著經濟和社會生活的發展，骨軟骨缺損的發病率逐年上升，據保守估計，美國每年大約有700萬因骨科疾病就診，醫療消耗約2150億美元。我國每年因多種病因誘發的骨關節病也為數眾多，消耗巨大。目前臨床采用的關節假體置換為有效的治療方法之一。但手術置換關節，不僅價格昂貴，且有并發癥危險。近年來應用生物學和工程學技術、原理研究開發替代用組織工程軟骨為軟骨缺損的修復開辟了新途徑和新方法。隨著組織工程技術發展，組織工程骨軟骨因同時具有類似骨、軟骨和骨軟骨間無縫移行區的結構，完全模擬構建自然的骨軟骨結構等優點，逐漸引起了國內外學者的關注，具有廣泛的應用前景。因而， 加強組織工程骨軟骨的應用基礎研究，闡明其在軟骨組織修復中的作用和轉歸機制，對于提高對組織工程骨軟骨的認識，拓展其應用范圍具有重要的科學意義。聚乳酸/ 聚羥基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)，在美國已通過FDA認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。這類材料無毒，無抗原性，具有良好的可降解吸收性、生物安全性和力學強度，可以通過控制成份含量來調節材料的降解速度，是目前骨軟骨組織工程研究和應用最為廣泛的一類材料。然而由于PLGA材料表面缺乏細胞識別位點以及親水性和細胞親和性不足，影響了細胞在其表面上的粘附生長，很大程度上限制了其臨床應用。近年來，隨著對PLGA改性研究的不斷進行，其性能得到不斷優化，一些新型PLGA材料相繼出現。例如①膠原修飾改性的PLGA仿生材料，采用離子表面處理方法在材料表面引入功能基團或功能鏈，可提高支架材料表面的黏附性。采用等離子處理PLGA膜，引入陽離子化的凝膠抗基，有效改善了細胞對PLGA降解支架材料的親和性。一種由HA/膠原/PLGA三層結構組成的納米復合膜，顯著提高了材料的生物活性。② 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD多肽)修飾改性PLGA，用交聯劑將RGD結合到PLGA微球表面進行改性，顯示提高細胞的粘附和細胞生長率。③羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA) 修飾改性PLGA，制備磷灰石/PLGA，多孔的PLGA/HA復合材料具有較好的韌性，提高骨結合能力。目前基于PLGA微球的組織工程支架，由于具有制備簡便，生物降解可控且降解產物毒性低、緩控釋等優點，而受到研究者的青睞。然而基于PLGA微球的組織工程骨軟骨在修復軟骨缺損中形成新生軟骨組織的數量和質量都遠未滿足臨床需要，主要原因是PLGA 微球大小不均一，粘附性低，孔隙率不均一，大多數細胞僅帖服在材料表面，無法向材料深部長入，缺乏足量的細胞種植，而無法獲得充足的細胞外基質結構，很大程度上限制了 PLGA 微球支架組織工程軟骨在臨床的應用。干細胞作為種子細胞一直是組織工程骨研究的熱點之一。胚胎干細胞(Embryonicstem cells, ESCs)系全能干細胞，具有無限增殖和體外長期培養后仍具有可誘導產生從滋養層到內、中、外胚層所有細胞的能力，但由于倫理學和致畸發生率偏高等原因使得基于 ESCs的組織工程骨研究相對滯后。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)能在體外增殖維持非分化狀態并具有分化成骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉、真皮及骨髓基質等中胚層組織的潛能，目前已在機體多個組織器官中成功提取到具有分化潛能的MSCs。在多來源的MSCs中，又以人類骨髓間充質干細胞(hBMSC)較多被應用于組織工程骨軟骨的研究，這些研究提示hBMSC將在組織工程骨軟骨方面具有廣泛的應用前景。

發明內容
本發明的目的在于提供一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，該微球支架微球橋連均勻，表面結構完整，未發生明顯溶解，保持理想孔隙率，可形成網狀結構，同時PLGA微球支架具有TGF-β 3/BMP-2梯度釋放特征。本發明的另一個目的在于提供上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架的制備方法，該制備方法工藝簡單、易于控制。本發明還有一個目的在于提供上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架在制備骨軟骨生物修復復合材料中的應用。本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，首先制備？11^均質微球以及16 -0 3和81^-2/ 11^ 微球，分別凍干備用，將凍干的上述微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調整ddH20在模具中的位置，上述微球在模具中堆積，采用無水乙醇燒結上述微球，即形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。其中PLGA為聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物(polydactic-co-glycolic acid), PLGA)，TGF- β 3 為轉化生長因子 _ β 3 (transforming growth factor β 3，TGF- β 3)， ΒΜΡ-2 為骨形態發生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2 )，ddH20 為雙蒸水。本發明所述的PLGA均質微球通過以下方法制備獲得按摩爾比為1:0.3-3，取乳酸和羥基乙酸隨機聚合生成PLGA，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將PLGA 溶解液經過均質形成均質聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經攪拌，過濾、洗滌和凍干后形成PLGA均質微球，儲存備用即可。其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為1_5%，聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后形成的混合溶液中PVA的質量百分含量為0. 1-1. 0%，攪拌時間為3-4h，凍干時間為 45-50h，儲存溫度為-20°C。采用本發明方法制備獲得PLGA微球具有良好梯度釋放性能、降解率、生物相容性，同時是一種均一直徑的微球，可顯著提高力學性能，同時可攜帶多種功能性的生物生長因子，間充質干細胞在PLGA支架上具有良好的成骨和軟骨分化能力。采用本發明方法制備的PLGA微球，微球大小均一適中，支架空隙率均一，隨著 PLGA微球降解形成小而均一的孔隙，進而可形成類似于松質骨的空間結構，可為骨軟骨再生重建提供物理支架和最佳的化學環境，伴隨種子細胞釋放進入支架內部，更有助于后期新生骨軟骨組織形成。
本發明所述的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球通過如下方法制備獲得將TGF-β 3溶于牛血清白蛋白BSA中制成TGF- β 3原液，將ΒΜΡ-2溶于牛血清白蛋白BSA中制成ΒΜΡ-2原液，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將TGF- β 3原液、ΒΜΡ-2原液和PLGA溶解液混勻，冰上超聲攪拌后形成均勻的乳液，將該乳液經過均質形成均質聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經攪拌，過濾、洗滌和凍干后形成TGF- β 3/BMP-2-PLGA 微球，儲存備用即可。采用本發明方法制備獲得的TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球，其中TGF- β 3和ΒΜΡ-2 生長因子作為種子細胞的生長誘導因子，可促進種子細胞向成骨和軟骨細胞方向分化， 有利于更多的原始細胞和修復細胞向損傷區域聚集，有利于營養物質和廢物的擴散。該 TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球安全無毒、具有良好的生物相容性、生物降解性，具有良好的成囊和成膜的性能。其中TGF- β 3原液的最終濃度為l_5Pg/mL，ΒΜΡ-2原液的最終濃度為0. 1-0. 5μδ/ mL, PLGA的溶解液中PLGA的質量百分含量為1_5%，TGF-β 3原液、ΒΜΡ-2原液和PLGA溶解液的體積比為1:1:20，冰上超聲攪拌時的時間為10-30秒，震動幅度為30-60% ；聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后形成的溶液中PVA的質量百分含量為0. 3-1%，攪拌時間為3-4h，凍干時間為45-50h，儲存溫度為-20°C。本發明所述的PLGA均質微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的粒徑為 50-300Mm。本發明所述的PLGA均質微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的質量比1 1。本發明采用可編程控制注射泵將該懸浮液注入底部設有過濾裝置的模具中，所述的模具為圓柱形玻璃容器，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/3-2/3，采用無水乙醇燒結PLGA均質微球以及TGF-β 3和 BMP-2/PLGA微球0. 5-1.證，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥后，在_20°C儲存即可。本發明的第二個目的是通過如下技術方案來實現的上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架的制備方法，含以下步驟
(1)制備PLGA均質微球，凍干備用；
(2)制備TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球，凍干備用；
(3)將凍干的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調整ddH20在模具中用量，在模具中堆積TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質微球，采用無水乙醇燒結TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質微球，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。本發明的第三個目的是通過如下技術方案來實現的上述基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架在制備骨軟骨生物修復復合材料中的應用。與現有技術相比，本發明具有如下優點
(1)本發明采用的原材料均為安全無毒的聚合物體系，PLGA由兩種單體一乳酸和羥基乙酸隨機聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機化合物，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域。在美國PLGA通過FDA認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥
(2)本發明制備的TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球中，TGF- β 3和ΒΜΡ-2作為種子細胞的生長誘導因子，可促進種子細胞向成骨和軟骨細胞方向分化，有利于更多的原始細胞和修復細胞向損傷區域聚集。(3)本發明制備的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球支架有一定的材料力學強度，使 PLGA微球支架在修復負重區骨軟骨缺損中的應用成為可能，新型合成技術制備PLGA微球支架可減少微球表面變性發生，有利于大量種子細胞進入支架內部，類似于松質骨的空間結構有利于營養物質和廢物的擴散，隨著PLGA微球降解形成小而均一的孔隙，可為骨軟骨再生和重建提供物理支架和最佳的化學環境，有助于后期新生骨軟骨組織形成，與周圍組織緊密接觸，易于操作、最大限度減少創傷，降低手術難度、減少病人痛苦、減少感染危險、 疤痕形成和治療費用。(4)本發明制備獲得微球支架中，成骨和軟骨誘導因子(ΒΜΡ-2和TGF-β 3)分別沿微球支架兩端向對側以最大濃度梯度釋放，種子細胞在PLGA支架內沿生長因子濃度梯度分化誘導形成類軟骨和類成骨細胞，并獲得類似自然結構的骨、軟骨和無縫移行區，可為骨軟骨的再生和重建提供最佳的空間環境，為骨軟骨再生重建提供最佳的物理化學環境， 模擬天然骨軟骨組織的細胞外基質成分，使材料具有優異的生物相容性及可調的物理機械性能、生物降解性能，更有助于后期新生骨軟骨形成。(5)本發明制備的新型梯度釋放PLGA微球支架不僅保留了 PLGA原有的良好生物相容性，而且還顯著提高了 PLGA微球支架的力學性能、骨軟骨誘導作用和攜帶種子細胞能力，具有優異的生物相容性，可攜帶足夠量的種子細胞，用于由腫瘤、外傷、嚴重感染、先天畸形等多種疾病造成的骨軟骨缺損的治療。(6)本發明制備工藝易于控制，操作簡便，采用本發明方法制備獲得微球支架可最大限度減少創傷，降低手術難度、減少病人痛苦、減少感染危險、疤痕形成和治療費用，在組織工程骨軟骨研究領域具有一定的先進性和創新性，可為組織工程骨軟骨研究和臨床應用提供新思路和新方法，該支架材料能夠實現產業化生產，相關產品具有較大的市場競爭力，可以很好地應用到各類基于軟骨缺損的修復中，充分發揮其良好、自然的修復能力，具有廣闊的臨床應用和市場前景。


圖1是實施例2中燒結制備的PLGA微球多孔性的支架的SEM圖以及人臍帶間充質基質細胞在支架中培養2周時的實時圖像，其中序號1和2 表示SEM顯示燒結制備的PLGA 微球多孔性的支架，序號1的圖中可見典型的微連接網狀結構，比例尺序號1和序號2分別為100 Mm和50 Mm，序號3和4的圖是人臍帶間充質基質細胞在支架中培養2周時的實時圖像，比例尺1000 Mm；
圖2是實施例2中燒結制備的PLGA微球多孔性的支架接種細胞培養3周熒光顯微照片，其中序號1表示活細胞和死細胞，序號2的圖表示活細胞，序號3的圖表示死細胞。比例尺100 Mm。圖3是實施例2中構建的TGF-β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架圖，其中序號 1表示制備的骨軟骨整體圖，序號2表示微觀圖。
具體實施例方式以下實施例僅用于闡述本發明，而本發明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所述技術領域的普通技術人員依據以上本發明公開的內容和各參數所取范圍，均可實現本發明的目的。實施例1
1.構建均質PLGA微球
制備直徑50Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :1的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經隨機聚合制成PLGA，用二氯甲烷DCM (DCM 30%ff/V,質量體積比)溶解 PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為3%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有 0. 5% (質量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干48小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。2.構建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
100 μδ ΒΜΡ-2加入10 mLO. 5 Pg/mL牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到 0. 2 Pg/mLBMP-2 原液。50 μδ TGF-β 3 用 25 Pg/mL BSA 溶解為 1 Pg/mL 的 TGF-β 3 原液， 500 mg PLGA 溶于 5mL DCM (WT6. 5 克，20%W/V)。250 μ ΒΜΡ_2 和 TGF-β 3 原液分別與 5 mL PLGA溶液混合，冰上超聲攪拌(50%震動幅度，20秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴， 流入含有質量百分含量為0. 5%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干48小時，-20°C 儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。不同粒徑的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球通過微粒崩流速控制微球粒徑，分批制備獲得。3.構建TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架
將直徑為50Mm的凍干TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球按質量體積(g/ mL)比為2. 5%分散在ddH20中，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球的質量比為1:1分別裝入20 mL注射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具 (直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾，微球在模具積累。使用一個額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/3，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球 1小時，形成TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，_20°C儲存。實施例2
1.構建均質PLGA微球
制備直徑IOOMffl的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :0. 3的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經隨機聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質量體積比) 溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為1%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有0.8% (質量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌3-4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干50小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。2.構建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 3 Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為2Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質量百分含量為21 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(50%震動幅度，20秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有質量百分含量為0. 3%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干50小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用上述制備獲得的直徑100 Mm TGF-i3 3和BMP-2 /PLGA微球以及直徑為IOOMm的空白PLGA微球制備4 mm (高)x 4 mm(直徑)的圓柱體結構支架。凍干TGF-β 3和ΒΜΡ-2/ PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH20 (2. 5%W/V)，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質量比為1:1分別裝入20 mL注射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾， 微球在模具積累。使用一個額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平， 使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的2/3，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結PLGA微球、TGF- β 3 和BMP-2/PLGA微球1小時，形成內部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，-20°C儲存。實施例3
1.構建均質PLGA微球
制備直徑150Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :2的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經隨機聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為5%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有 1.0% (質量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干45小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。2.構建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 4 Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為3Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質量百分含量為3% 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(50%震動幅度，30秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有質量百分含量為0. 8%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干50小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑150 Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為150Mm的空白PLGA微球制備4 mm (高)χ 4 mm(直徑)的圓柱體結構支架。凍干TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH20 (2. 5%W/V)，其中TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質量比為1:1，分別裝入20mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾，微球在模具積累。使用一個額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積 PLGA微球、TGF-β 3和 BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結PLGA微球、TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球1小時，形成內部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2 天，-20°C儲存。實施例4
1.構建均質PLGA微球
制備直徑200Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :3的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經隨機聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為2%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有 0.3% (質量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干47小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。2.構建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 5Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為5Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質量百分含量為5% 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(60%震動幅度，10秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有質量百分含量為1. 0%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干47小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑200 Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為200Mm的空白PLGA微球制備4 mm (高)χ 4 mm(直徑)的圓柱體結構支架。凍干TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH20 (2. 5% W/ V)，其中TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質量比為1:1，分別裝入20 mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾，微球在模具積累。使用一個額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積 PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。100%乙醇燒結PLGA微球1小時，形成內部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，_20°C儲存。實施例5
1.構建均質PLGA微球
制備直徑250Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :0. 5的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經隨機聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為2. 5%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有0.6% (質量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌3-4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干49小時，_20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。不同粒徑的均質 PLGA微球通過微粒崩流速控制微球粒徑，分批制備獲得。2.構建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. 35Pg/mLBMP_2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為4. 5Pg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質量百分含量為 3. 5%的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20 混合，冰上超聲攪拌(50%震動幅度，30秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有質量百分含量為0. 5%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3 和BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干49小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑250Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為250Mm的空白空白PLGA微球制備4mm(高)x4mm(直徑)的圓柱體結構支架。凍干TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球和空白 PLGA微球分散在ddH20(2. 5%ff/V,微球與水的質量體積比)，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質量比為1:1，分別裝入20 mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾， 微球在模具積累。使用一個額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平， 使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結PLGA微球、、TGF- β 3 和BMP-2/PLGA微球1小時，形成內部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，-20°C儲存。實施例6
1.構建均質PLGA微球制備直徑300Mm的PLGA微球。PLGA組成(摩爾比為1 :1的乳酸羥乙酸，聚合物的分子量 25，000)經隨機聚合制成PLGA，用DCM (二氯甲烷)(DCM 30%W/V，質量體積比)溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為5%，該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有 0. 5% (質量百分含量)PVA的燒杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需攪拌 3-4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后，PLGA聚合物微球凍干48小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。不同粒徑的均質PLGA 微球通過微粒崩流速控制微球粒徑，分批制備獲得。2.構建 TGF-β 3 和 BMP-2/PLGA 微球
取BMP-2加入牛血清白蛋白(BSA)在PBS (磷酸鹽緩沖液)得到0. ^g/mLBMP-2原液。 取TGF- β 3用BSA溶解為Wg/mL的TGF- β 3原液，取PLGA溶于DCM得質量百分含量為1% 的PLGA溶解液，將ΒΜΡ-2原液和TGF- β 3原液分別與PLGA溶解液按體積比為1 1 20混合，冰上超聲攪拌(50%震動幅度，30秒)，形成均勻的PLGA蛋白乳液。該聚合物溶液通過超聲波傳感器控制波形發生器，經一個小號同軸噴針頭，產生均質聚合物液滴，流入含有質量百分含量為0. 5%的PVA燒杯中，形成TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF- β 3和 BMP-2/PLGA聚合物液滴需攪拌3_4小時，隨后硬化形成微球，過濾后用蒸餾水廣1L)以去除殘留的PVA。最后TGF- β 3和BMP-2/PLGA聚合物微球凍干48小時，-20°C儲存，測量微球直徑和內部結構、形態備用。TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架通過如下方法制備獲得
采用直徑300Mm TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及直徑為300Mm的空白空白PLGA微球制備4mm(高)x4mm(直徑)的圓柱體結構支架。凍干TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球和空白 PLGA微球分散在ddH20(2. 5%ff/V,微球與水的質量體積比)，其中TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球與空白PLGA微球的質量比為1:1，分別裝入20 mL射器。使用可編程控制注射泵將該懸浮液注入圓柱形玻璃模具(直徑4毫米)。模具底部裝有過濾器(顆粒保留〉3Mm)，ddH20過濾， 微球在模具積累。使用一個額外的輸液泵和真空注射器泵，使蒸餾水在模具保持一定水平， 使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/2，堆積PLGA微球、TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球。無水乙醇燒結PLGA微球、、TGF- β 3 和BMP-2/PLGA微球1小時，形成內部空間為六角形TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥2天，-20°C儲存。以下為上述實施例構建的TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架的應用試驗 1. hBMSCs 培養
自體hBMSCs的體外培養和成骨誘導從患者骼后上棘經穿刺抽取骨髓10-20 mL，將獲取的骨髓置于Percoll分離液上(密度1.073 g/L，Pharmacia公司，美國)，骨髓與分離液的比例為1 2,2 550 r/min離心30 min，吸取中間云霧狀細胞層，以2X IO7 cell/cm2 的密度接種于培養皿，進行體外細胞擴增，取第四代hBMSCs備用。
表1實驗分組共計10組
權利要求
1.一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是通過以下方法制備獲得首先制備PLGA均質微球以及TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球，分別凍干備用，將凍干的上述微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調整ddH20在模具中的位置，上述微球在模具中堆積，采用無水乙醇燒結上述微球，即形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架即 TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。
2.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是所述的PLGA均質微球通過以下方法制備獲得按摩爾比為1:0. 3-3，取乳酸和羥基乙酸隨機聚合生成PLGA，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將PLGA溶解液經過均質形成均質聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經攪拌，過濾、 洗滌和凍干后形成PLGA均質微球，儲存備用即可。
3.根據權利要求2所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是其中PLGA溶解液中PLGA的質量百分含量為1_5%，聚合物液滴與聚乙烯醇 PVA混勻后形成的混合溶液中PVA的質量百分含量為0. 1-1. 0%，攪拌時間為3-4h，凍干時間為45-50h，儲存溫度為_20°C。
4.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是所述的TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球通過如下方法制備獲得將TGF- β 3溶于牛血清白蛋白BSA中制成TGF-β 3原液，將ΒΜΡ-2溶于牛血清白蛋白BSA中制成ΒΜΡ-2原液，將PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，將TGF- β 3原液、ΒΜΡ-2原液和PLGA溶解液混勻，冰上超聲攪拌后形成均勻的乳液，將該乳液經過均質形成均質聚合物液滴，將該聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后，經攪拌，過濾、洗滌和凍干后形成TGF- β 3/BMP-2-PLGA 微球，儲存備用即可。
5.根據權利要求4所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是其中TGF-β 3原液的最終濃度為l_5Pg/mL，ΒΜΡ-2原液的最終濃度為 0. 1-0. 5Pg/mL，PLGA的溶解液中PLGA的質量百分含量為1-5%，TGF_3 3原液、ΒΜΡ-2原液和 PLGA溶解液的體積比為1:1:20，冰上超聲攪拌時的時間為10-30秒，震動幅度為30-60%; 聚合物液滴與聚乙烯醇PVA混勻后形成的溶液中PVA的質量百分含量為0. 3-1%，攪拌時間為3-4h，凍干時間為45-50h，儲存溫度為-20°C。
6.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是所述的PLGA均質微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的粒徑為50_300Mm。
7.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是=PLGA均質微球以及TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球的質量比1:1。
8.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，其特征是采用可編程控制注射泵將該懸浮液注入底部設有過濾裝置的模具中，所述的模具為圓柱形玻璃容器，使用輸液泵和真空注射泵使ddH20在圓柱形玻璃容器中的位置為充滿圓柱形玻璃容器下部的1/3-2/3，采用無水乙醇燒結PLGA均質微球以及TGF-β 3和 BMP-2/PLGA微球0. 5-1.證，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架，冷凍干燥后，在_20°C儲存即可。
9.權利要求1-8任一項所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架的制備方法，其特征是包含以下步驟(1)制備PLGA均質微球，凍干備用；(2)制備TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球，凍干備用；(3)將凍干的TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質微球分散于ddH20中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設有過濾裝置的模具中，采用ddH20過濾并調整ddH20在模具中用量，在模具中堆積TGF-β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質微球，采用無水乙醇燒結TGF- β 3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均質微球，形成基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架即TGF- β 3/ ΒΜΡ-2梯度釋放PLGA微球支架。
10.權利要求1-8任一項所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架在制備骨軟骨生物修復復合材料中的應用。
全文摘要
一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的生長因子梯度釋放微球支架，該微球支架是通過如下方法制備獲得的首先制備PLGA均質微球以及TGF-β3和BMP-2/PLGA微球，將兩微球分散于ddH2O中制成懸浮液，然后將該懸浮液注入底部設有過濾裝置的模具中，采用ddH2O過濾并調整ddH2O在模具中的位置，上述微球在模具中堆積，采用無水乙醇燒結上述微球即形成。本發明制備的微球支架不僅保留了PLGA原有的良好生物相容性，而且顯著提高了微球支架力學性能、骨軟骨誘導作用和攜帶種子細胞能力，具有優異的生物相容性，可攜帶足夠量的種子細胞，用于由腫瘤、外傷、嚴重感染、先天畸形等多種疾病造成的骨軟骨缺損的治療。
文檔編號A61L27/18GK102319449SQ20111021564
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者趙亮 申請人:趙亮