專利名稱：Btg2在制備抑制癌癥轉移藥物中的應用的制作方法
BTG2在制備抑制癌癥轉移藥物中的應用技術領域
本發明屬于基因藥物領域，具體涉及BTG2基因(B細胞遷移基因幻在制備抑制癌 癥轉移藥物中的應用。
背景技術：
乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一。據美國癌癥學會2010年最新統計 數據，乳腺癌發病率占女性惡性腫瘤第一位，死亡率居女性惡性腫瘤第二位。在我國，乳腺 癌的發病率也呈逐年上升趨勢，近10年來，我國乳腺癌發病率增加了 47%。與歐美國家 相比較，中國乳腺癌病人的年齡呈現年輕化趨勢。按我國12億人口計算，每年將新發現 211，000例乳腺癌。乳腺癌治療最終失敗并導致患者死亡的主要原因是遠處轉移。
因此，需要研發出一種抑制癌癥轉移的藥物。
現有技術中，關于BTG2基因的報道，主要集中在其抑制腫瘤增長方面的應用， 例如馬曉明、倪克樑等利用RT-PCR法研究31例人胰腺癌及同例癌旁組織BTG2mRNA的 表達，利用免疫沉淀法檢測其BTG2蛋白的表達，用pcDNA3. 1-BTG2質粒轉染人胰腺癌 細胞株swl990，用MTT法測定質粒轉染后swl990/pcDNA3. 1-BTG2細胞生長曲線；應用 AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑，用流式細胞儀測定swl990/pcDNA3. 1-BTG2細胞凋亡的情 況，結果發現BTG2基因在人胰腺癌中的表達下調可能與其惡性行為有關；BTG2基因的過度 表達可通過誘導凋亡而抑制人胰腺癌細胞株swl990的生長(參見馬曉明、倪克樑.世界 腫瘤雜志· 20-24)。
然而BTG2基因在制備抑制癌癥轉移藥物的應用國內外至今未見報道。 發明內容
本發明目的是提供一種BTG2基因的新應用，即BTG2基因在制備抑制癌癥轉移藥 物中的應用。
為達到上述目的，本發明采用的技術方案是BTG2基因在制備抑制癌癥轉移藥物 中的應用，具體的，脂質體介導的真核表達質粒PCDNA3-BTG2在制備抑制癌癥轉移藥物中 的應用。
本發明同時要求保護一種抑制癌癥轉移藥物，所述抑制癌癥轉移藥物的活性成分 包括攜帶BTG2基因的真核表達質粒。
上述技術方案中，所述攜帶BTG2基因的真核表達質粒為真核表達質粒 pcDNA3-BTG2。
上述技術方案中，真核表達質粒PCDNA3-BTG2的制備方法為現有技術，可以參見 文獻張林、侯艷紅、王孟薇、吳本儼、李楠.中華腫瘤防治雜志.200815 (16)。
上述技術方案中，所述癌癥包括但不限于乳腺癌。
由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
本發明將脂質體介導的真核表達質粒pcDNA3-BTG2導入腫瘤細胞，使BTG2基因在3腫瘤細胞中表達，然后BTG2基因通過抑制腫瘤細胞周期進程和影響細胞周期進程和細胞 轉移相關蛋白的表達，抑制了腫瘤細胞的遠處轉移能力。


圖1為實施例一中轉染BTG2質粒后MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞BTG^nRNA表 達情況；
圖2為實施例一中轉染BTG2質粒后MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞BTG2蛋白表 達水平；
圖3為實施例一中BTG2基因抑制MCF-7細胞遷移；
圖4實施例一中BTG2基因抑制MDA-MB-231細胞遷移；
圖5為實施例一中BTG2基因抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞轉移；
圖6為實施例一中SuperArray轉移相關基因芯片(0HS-028)中含有的基因；
圖7為實施例一中轉染BTG2基因后MDA-MB-231細胞SuperArray結果；
圖8為實施例一中BTG2轉染MDA_MB_231細胞肺克隆實驗典型圖9為實施例一中裸鼠正常肺臟和肺轉移病理(HE，X 200)；其中，A裸鼠正常肺 臟病理，B裸鼠肺轉移灶病理。
具體實施方式
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述
實施例一
材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231及MCF-7購于美國細胞收藏中心(ATCC)，并 由本實驗室保存和培養；D-MEM培養基干粉，小牛血清，胰酶粉末購自Gibco公司；標準蛋 白質分子量、SDS-PAGE上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、TE電泳緩沖液、IOX轉膜液、30% Acry-Bis、Tris-Hcl、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)購自江蘇 碧云天生物技術研究所；二甲基亞砜(DMS0)、瓊脂糖和Tween-20來自上海高科技生物工程 有限公司；抗BTG2、cyclin Bi、cyclin Dl等抗體購自美國Santa Cruzs生物技術公司。 RNase A 和 10g/mL proteinase K 購自美國 Sigma Aldrich 公司。
1)細胞培養MDA-MB_231及MCF-7細胞培養于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100 萬U/L青霉素和鏈霉素的D-EME培養基。細胞置于5% CO2, 37°C培養箱內培養，每2_3天 傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。
2)細胞的轉染和克隆篩選轉染前一天，將細胞用胰酶消化、計數，以合適的密度 接種6孔板，置于CO2培養箱中培養過夜，使轉染當日細胞融合度為70% 90%。在鋪板 和轉染期間避免使用抗生素。轉染溶液配制質粒LipOfectamine2000用量比為1 μ g/ 孔2. 5 μ 1/孔。2 μ g/孔DNA加入100 μ 1/孔DMEM混勻，室溫靜置5min，備用；5 μ 1/孔 Lipofectamine2000加入100 μ 1/孔基礎DMEM混勻，室溫靜置5min，備用；將稀釋的DNA同 稀釋的脂質體試劑混合，在室溫保溫30min后，加入800 μ 1/孔基礎DMEM，備用。用PBS及 無抗生素的基礎DMEM洗滌細胞，每孔加入Iml轉染混合液，5% C02，37°C培養證。證后，棄 去含轉染試劑的培養液，加入新鮮的完全培養基，繼續培養后，72小時內完成實驗即為瞬時 轉染；如果細胞繼續培養4 后，更換含G418的培養基，大約兩周后，篩選陽性穩定克隆，即為穩定轉染。
應用脂質體轉染的方法，將前述所構建的真核表達質粒pCDNA3-BTG2分別轉染到 人類乳腺癌MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞，同時轉染“空”的pcDNA3質粒作為陽性對照。 MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞轉染BTG2基因后的RT-PCR電泳圖見圖1。從圖中可以看 出，MCF-7/BTG2細胞和MDA-MB-231/BTG2細胞中BTG2mRNA明顯高表達，而相應的母細胞和 空質粒細胞中BTG2mRNA均為極低表達。MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞轉染BTG2基因后 的Western blot電泳圖見圖2。從圖中可以看出，MCF-7/BTG2和MDA-MB-231/BTG2細胞中 的BTG2蛋白表達水平明顯高于相應的母細胞和轉染“空”質粒的細胞，同時，母細胞和轉染 “空”質粒的細胞BTG2蛋白表達水平相同。
以上結果從RNA水平和蛋白水平均證明，BTG2基因已經轉染進入乳腺癌細胞 MCF-7和MDA-MB-231細胞，并且可以使乳腺癌細胞高表達BTG2蛋白，同時“空”的pcDNA3 質粒沒有影響BTG2蛋白表達。
上述flfestern-blot法方法的主要過程為收集細胞并轉至于1. 5ml的Eppendorf 管中離心O500轉/分)5分鐘，棄上清，并加入ΙΟΟμ 1 IP裂解液，置于冰上2小時。4。C 離心5分鐘(2，500轉/分鐘)，轉移上清液至新的Eppendorf管，并采用分光光度計檢測樣 品蛋白含量。加入蛋白上樣緩沖液(5Χ)混勻，置于恒溫混勻器上，100°C 5分鐘，蛋白電泳 后轉至醋酸纖維膜上。膜采用封閉液(5%脫脂奶粉，IXT-BST緩沖液)封閉lh。洗滌，并 分別加入一抗β-Actin，BTG2，Cyclin Bi, Cyclin D1，經封閉液處理的醋酸纖維膜室溫撫 育1小時。T-BST緩沖液洗膜3次，加入二抗(1 1000稀釋)撫育1小時。T-BST緩沖液 洗膜3次，最后加ECL發光劑，顯影、定影，膠片洗滌和干燥后，掃描分析。
3)體外劃痕實驗采用體外劃痕方法測定細胞遷移能力。取對數生長期細胞，按 IXlO6Ail接種于6孔培養板，培養至細胞完全飽和。用無菌2001的Tip頭垂直劃出一無 細胞的細痕，制作培養細胞傷口模型，并用無菌IXPBS小心清洗三次去除漂浮細胞(此時 作為劃痕后0時刻)。每板接種三種細胞，每種細胞設2個復孔。最后分別繼續培養M小 時和48小時，在顯微鏡下觀察劃痕寬度，并采用數碼照相機拍照。
應用體外細胞劃痕實驗方法檢測BTG2基因對乳腺癌細胞體外遷移能力的影響。 圖3為轉染BTG2基因后MCF-7細胞的劃痕實驗結果，從圖中可以看出，隨時間延長，細胞向 劃痕區域浸潤擴散，MCF-7/BTG2細胞較MCF-7和MCF-7/Neo細胞浸潤慢，在劃痕后48小時， MCF-7/BTG2細胞劃痕間隙明顯大于MCF-7細胞和MCF-7/Neo細胞，而MCF-7細胞和MCF-7/ Neo細胞之間差異不明顯。
圖4為轉染BTG2基因后MDA-MB-231細胞的劃痕實驗結果，與MCF-7細胞類似， 在劃痕后48小時，MDA-MB-231和MDA-MB-231/Neo細胞已經浸潤擴散覆蓋了劃痕間隙，而 MDA-MB-231/BTG2細胞仍可看到明顯的劃痕間隙。
以上實驗結果說明BTG2基因表達水平的提高可以抑制或降低乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231的遷移能力，同時也說明“空”pcDNA 3質粒對乳腺癌細胞的遷移能力沒有明顯影響。
4) Boyden 小室實驗
采用Boyden小室法測定細胞轉移能力。在Boyden下室加入含20%的新生牛血清 的DMEM培養基，采用8 μ m人工基底膜將兩室隔開。加40 μ 1不含血清的DMEM培養基制備5的單細胞懸液(IXlO6Ail)接種到Boyden上室中。細胞置于37 °C、5% CO2飽和濕度培養8 小時。小心將基底膜取出，甲醇固定，并采用Giemsa染色，用棉簽將未穿過膜的細胞小心擦 去，然后在顯微鏡下觀察并拍照。
應用體外Boyden小室實驗方法研究BTG2基因對乳腺癌細胞MCF-7和MDA_MB_231 轉移能力的影響。結果如圖5所示，使用8μπι人工基底膜，8小時之后，MDA-MB-231和 MDA-MB-231/Neo均有大量細胞穿過基底膜，而MDA-MB-231/BTG2細胞僅有少量細胞穿過基 底膜。MCF-7細胞也有同樣的結果。通過在顯微鏡(100倍)下計數每視野穿過基底膜的 細胞數目，每組細胞計數6個視野，應用SAS8. O統計軟件，對數據進行方差分析。結果發 現:MDA-MB-231 與 MDA-MB-231/Neo 之間 ρ = 0. 2123，差異無統計學意義，MDA-MB-231 與 MDA-MB-231 /BTG2、MDA-MB-231 /Neo 與 MDA-MB-231 /BTG2 之間，ρ 值均 < O· 01，細胞數具有明 顯差異。MCF-7與MCF-7/Neo之間ρ = 0. 0892，差異無統計學意義，MCF-7與MCF-7/BTG2、 MCF-7/Neo與MCF-7/BTG2之間，ρ值均< 0. 01，細胞數具有明顯差異。以上結果說明，BTG2 基因表達增加可以抑制了乳腺癌細胞MCF-7，MDA-MB-231的轉移能力。
5) SuperArray功能分類基因芯片實驗應用美國SABiosciences公司的 SuperArray 轉移相關基因芯片(0HS-028)，對 MDA-MB-231/Neo 和 MDA-MB-231/BTG2 細胞分 別進行檢測，具體方法如下
首先提取待測細胞的總RNA(具體方法同RT-PCR)；提取總RNA后進行測量總RNA 溶解于 RNase-free water, A260 > llng/ul, A260/A280 > 2. 0，A260/A230 > 1. 7 ；進行變 性瓊脂糖電泳(看RNA的完整性，18S和28S條帶)；應用"TrueLabeling_AMP2. O試劑盒進行 cRNA合成與放大，具體步驟參照試劑盒說明進行。純化后、Biotin標記的cRNA即可用于上 含基因芯片的膜雜交含基因芯片的每個雜交管中加入Iml的雜交緩沖液，然后加入20 μ g 的biotin標記的cRNA，上雜交爐60°C，15 20轉/min，過夜。按說明將經過雜交的基因 芯片膜洗滌后，應用CDP-Mar化學發光試劑盒進行反應顯色。對反應后的基因芯片膜應用 Kodak X光片進行曝光、顯影后，得到superarray圖像，然后根據相應基因位點對圖像進行 分析。
結果如圖6所示，0HS-028轉移相關基因芯片上含有與腫瘤轉移相關的113個基 因。經過分析，有7個基因有較明顯差異，結果如圖7所示，分別為SET、NMEU NME2、RBI、 RH0C、PLAUR和P53。其中，BTG2基因導致上調的是SET、NMEl、NME2、RBl和P53基因，導致 下調的是RHOC和PLAUR。
SET、RB和P53基因與調節細胞周期、凋亡有關，BTG2基因引起這些基因上調，說明 BTG2對細胞周期和凋亡的作用可能與上調這些基因表達，影響了相關的信號通路有關。
NMEU NME2、RHOC和PLAUR這些基因與腫瘤細胞的轉移能力有關，BTG2基因引起 這些基因的上調和下調，說明BTG2基因對腫瘤細胞轉移的抑制可能與這些基因相關的信 號通路有關。
6)乳腺癌轉移模型建立取對數生長期MDA-MB-231/Neo細胞、MDA-MB-231/BTG2 細胞，經0. 25%胰蛋白酶消化，離心去上清，而后用基礎培養液離心洗滌2次，計數細胞數， 調整細胞濃度為IX IO6個/mL，將細胞重懸于無菌PBS溶液。取前述裸鼠12只，每種細胞 種6只，將裸鼠放入固定器中，在嚴格無菌條件下經尾靜脈注入細胞懸液0. 2mL·裸鼠腫瘤 接種后，連續置恒溫(25°C ±2°C)、恒濕(45% 50%)、無菌凈化屏障系統內飼養，定期觀察裸鼠精神、飲食和排便。裸鼠飼養4周脫頸處死，解剖，取出雙肺。Bouin氏液固定雙肺， 放大鏡下觀察、計數肺結節。最后常規石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡觀察。
結果顯示MDA-MB-231/Neo細胞組6只均有肺轉移，MDA-MB-231/BTG2組僅發現3 只有肺轉移。肉眼觀典型的肺轉移為兩肺分布多個大小不等的粟粒狀淺黃色結節，以下肺 多見。結果見表2和圖8和9。
表2MDA-MB-231細胞肺轉移模型結果
權利要求
1.BTG2基因在制備抑制癌癥轉移藥物中的應用。
2.脂質體介導的真核表達質粒pcDNA3-BTG2在制備抑制癌癥轉移藥物中的用。
3.一種抑制癌癥轉移藥物，其特征在于，所述抑制癌癥轉移藥物的活性成分包括攜帶 BTG2基因的真核表達質粒。
4.根據權利要求3所述抑制癌癥轉移藥物，其特征在于，所述攜帶BTG2基因的真核表 達質粒為真核表達質粒pcDNA3-BTG2。
全文摘要
本發明屬于基因藥物領域，具體涉及BTG2基因(B細胞遷移基因2)在制備抑制癌癥轉移藥物中的應用。本發明將脂質體介導的真核表達質粒pcDNA3-BTG2導入腫瘤細胞，使BTG2基因在腫瘤細胞中表達，然后BTG2基因通過抑制腫瘤細胞周期進程和影響細胞周期進程和細胞轉移相關蛋白的表達，抑制了腫瘤細胞的遠處轉移能力。
文檔編號A61K48/00GK102028956SQ20101058573
公開日2011年4月27日 申請日期2010年12月13日 優先權日2010年12月13日
發明者樊賽軍, 胡旭東 申請人:蘇州大學