專利名稱：無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌-AC群腦膜炎球菌聯合疫苗的制作方法
技術領域：
本發明提供一種吸附無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗。即由吸附無細胞百白破聯合疫苗、b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌結合疫苗聯合而成的六聯疫苗，用以預防百日咳、白喉、破傷風及由A、C群腦膜炎球菌引起的腦脊髓膜炎，由b型流感嗜血桿菌引起的中耳炎、腦膜炎等疫苗，屬于疫苗生產制備技術領域。
背景技術：
傳染病至今仍是導致嬰幼兒死亡的重要原因，在全世界可通過免疫接種來預防的疾病已達三十多種。據統計兒童入學前需接受預防注射達21次左右，按現行的免疫程序，免疫計劃很難安排。改進現有疫苗，減少接種針次，提高疫苗的可接受性已勢在必行。聯合疫苗是新型疫苗研發的主要方向之一。聯合疫苗較之單價疫苗有如下優點更少的針次；減少嬰幼兒創傷；提高復雜的免疫計劃表的實施效率，減少漏種；更高的疫苗覆蓋率；更低的空間存放要求；有助于新品種的疫苗增加到免疫計劃表中。以無細胞百白破聯合疫苗(DTaP)為基礎的聯合疫苗是研究的熱點。不少新疫苗的出現，不僅使聯合疫苗的研制變得日趨迫切，使聯合疫苗的組成成分越來越多，百日咳(P)、白喉(D)、破傷風(TT)等疾病在我國流行范圍廣，危害程度相當嚴重，及時進行疫苗接種，是唯一有效的預防保護性措施。侵襲性b型流感嗜血桿菌(Hib)是我國兒童呼吸道感染的重要致病菌，是引起細菌性腦膜炎和細菌性肺炎的主要病原菌。肺炎鏈球菌是兒童肺炎，急性中耳炎，腦膜炎，心內膜炎，敗血癥的主要致病菌。我國每年有250萬人患肺炎球菌性肺炎，并造成12. 5萬人死亡。腦膜炎奈瑟氏球菌(Nm)是流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦)的主要病因，并且是唯一能引起腦膜炎大流行的細菌，在許多國家仍然嚴重威脅大眾健康。據WHO估計，全球每年由腦膜炎球菌引起約30萬一35萬的病例。與美國或西歐(發病率為14 / 10萬)相比，許多發展中國家發病率更高(約25 / 10萬)。因此開展吸附無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗是針對已有技術的拓展與延伸，可為我國兒童預防傳染病工作提供質優價廉的聯合疫苗，創造較好的社會效益和經濟效益。由于流行病分布的差異，國外還未上市包含DTaP、Hib莢膜多糖蛋白結合物與AC群腦膜炎球菌莢膜多糖蛋白結合物聯合的疫苗。目前國內外的相關產品主要有GlaxoSmithKline Biologicals(GSK)公司生產的 Infanrix-Hib ,它是具有 DTaP/Hib 抗原的聯合疫苗。其中DTaP抗原為液體，Hib抗原為凍干制劑，兩部分抗原分開包裝。GSK還生產DTaP與IPV聯合的Kinrix 聯合疫苗，包含DTaP與乙肝抗原和IPV成分的Pediarix 。Sanofi Pasteur生產的Pentacel 是包含DTaP-IPV和Hib抗原的聯合疫苗。國內雖有相似產品的專利(申請號200910067156)，但說明書中僅描述流腦多糖生產工藝，過程公開不充分，且尚無產品上市。這是因為六聯疫苗成分復雜，疫苗成分的簡單混合可能引起的抗原干擾，導致多糖特異性抗體滴度降低，加之各單組分疫苗混合后質控標準難以確立，內毒素標準難以達到等因素所致。因此在疫苗配比過程中，需要長期疫苗生產經驗的積累與國外臨床研究的反饋，并進行免疫干擾相關研究，確認其安全有效的范圍。由于疫苗成分復雜，除有效成分外，其他組分，如凍干賦形劑等組分，會對檢測方法造成一定的干擾。如乳糖就會對多種多糖的游離多糖檢測造成干擾。

發明內容
本發明的任務是提供一種吸附無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗，使其具有安全、有效、可控及一針防多病的特點，并符合2010版《中國藥典》三部“吸附無細胞百白破聯合疫苗” “b型流感嗜血桿菌結合疫苗” “A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”及擬定“吸附無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗制造與檢定規程”的相關要求，以實現能實際應用的目的。實現本發明的技術方案是本發明提供的這種聯合疫苗由以下組分(a)和組分 (b)組成(a)吸附無細胞百白破聯合疫苗；(b) b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗；(a)和(b)分別裝在分開的容器中。所述的(a)吸附無細胞百白破聯合疫苗是按以下方法制備的(I)制備各單價疫苗原液(I)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中國藥典》“吸附百白破聯合疫苗”中附錄I “百日咳疫苗原液制造及檢定要求”工作種子批經血清學試驗、皮膚壞死試驗、毒力試驗和效價測定后凍干保存，工作種子批菌種啟開后，接種于培養基，如改良包-姜培養基或活性炭半綜合培養基，于35 37°C培養不超過72小時，經純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中；采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液；(II)白喉菌種工作種子批傳代至產毒培養基種子管2 3代，再傳至產毒培養基培養制成生產用種子，采用培養罐液體培養，培養過程中嚴格控制雜菌污染，檢測培養物濾液，毒素效價不低于150Lf/ml時收獲，收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制，精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進行脫毒,脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素；(III)破傷風菌種工作種子批先在產毒培養基種子管中傳廣3代，再轉至產毒培養基制成生產用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經加深水解后的培養基作為生產用培養基。采用培養罐液本培養，培養過程應嚴格控制雜菌污染，檢測培養物濾液，毒素效價不低于40Lf/ml時收獲毒素,毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進行脫毒,制成類毒素，即為破傷風類毒素；(2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應為淺藍色或乳白色膠體懸液，將白喉類毒素、破傷風類毒素及無細胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細胞百白破聯合疫苗。
所述的(b) b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗是按以下方法制備的(I)制備各單價疫苗原液(I) A群腦膜炎球菌結合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；
依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存；(II) C群腦膜炎球菌結合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存；(III)b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”中檢定要求對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入一定濃度碳二亞胺(EDAC)冰浴反應一定時間，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液，于2l°C保存； (2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌多糖結合原液與b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖計)混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗。本發明提供的聯合疫苗的制備方法，包括以下步驟步驟一制備吸附無細胞百白破聯合疫苗 (I)制備各單價疫苗原液(I)百日咳菌種工作種子批啟開后，接種于培養基，如改良包-姜培養基或活性炭半綜合培養基，于35 37 °C培養不超過72小時，經純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液；(II)白喉菌種工作種子批傳代至產毒培養基種子管2 3代，再傳至產毒培養基培養制成生產用種子。采用培養罐液體培養，培養過程中嚴格控制雜菌污染。檢測培養物濾液，毒素效價不低于150Lf/ml時收獲。收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進行脫毒。脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素；(III)破傷風菌種工作種子批先在產毒培養基種子管中傳f 3代，再轉至產毒培養基制成生產用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經加深水解后的培養基作為生產用培養基。采用培養罐液本培養，培養過程應嚴格控制雜菌污染。檢測培養物濾液，毒素效價不低于40Lf/ml時收獲毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進行脫毒,制成類毒素，即為破傷風類毒素；(2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應為淺藍色或乳白色膠體懸液。將白喉類毒素、破傷風類毒素及無細胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細胞百白破聯合疫苗；步驟二 制備b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗
(I)制備各單價疫苗原液(I) A群腦膜炎球菌結合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去 溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存；(II) C群腦膜炎球菌結合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存；(III) b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 - 8°C靜置I 一 3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ；離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”中檢定要求對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼( ADH)反應適宜時間后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量碳二亞胺(EDAC)冰浴反應1-4小時，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液，于2l°C保存；(2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌結合疫苗原液與b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖計)混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗；步驟三分裝將上述制備的吸附無細胞百白破聯合疫苗與b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗分別分裝在預充式注射器與低硼硅西林瓶中。所述腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖與b型流感嗜血桿菌莢膜多糖為各自偶聯至載體蛋白上，如偶聯至破傷風類毒素。其中，多糖蛋白偶聯物中，多糖蛋白比在I :2至I :4之間。載體蛋白的選擇上，可為破傷風類毒素，也可為白喉類毒素載體或CRM197等適宜蛋白。本發明提供的疫苗在使用時將以下兩種組分臨用前混合(a)吸附無細胞百白破聯合疫苗；(b) b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗；(a)和(b)分別裝在分開的容器中。本發明聯合疫苗的制備工藝，包括以下步驟本發明疫苗可以O. 5ml的劑量給予接種者。所述混合的偶聯物組分未經佐劑處理；所述混合的偶聯物組分不含汞防腐劑；所述(b)部分的偶聯物為凍干制劑；所述(b)部分賦形劑包含乳糖或(和)甘氨酸。國內雖有相似產品的專利(申請號200910067156)，但說明書中僅描述流腦多糖生產工藝，過程公開不充分，且尚無產品上市。這是因為六聯疫苗成分復雜，疫苗成分的簡單混合可能引起的抗原干擾，導致多糖特異性抗體滴度降低，加之各單組分疫苗混合后質控標準難以確立，內毒素標準難以達到等因素所致。因此在疫苗配比過程中，需要長期疫苗生產經驗的積累與國外臨床研究的反饋，并進行免疫干擾相關研究，確認其安全有效的范圍。由于疫苗成分復雜，除有效成分外，其他組分，如凍干賦形劑等組分，會對檢測方法造成一定的干擾。如乳糖就會對多種多糖的游離多糖檢測造成干擾。故本專利申請中采用甘氨酸作為賦形劑，以凍干曲線，探索出適宜的凍干方法，添加退火步驟，使凍干效果更佳。故本專利申請提供的是一種穩定的吸附無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗，所述生產工藝、產品劑型與添加的輔料及效果與現有技術相比有實質不同，具有顯著的進步。本發明的優點在于(I)接種一種疫苗就可預防百日咳，白喉，破傷風，由A、C群腦膜炎球菌引起的腦脊髓膜炎，b型流感嗜血桿菌引起的腦膜炎，中耳炎等疾病。(2)提高疾覆蓋率，減少漏種。(3)減少疫苗的多次接種對兒童及其家長帶來的痛苦和負擔。(4)生產過程可控，產品安全有效。
具體實施例方式本發明包括但不限于以下實施例。實施例I :一、吸附無細胞百白破聯合疫苗制備( I)制備各單價疫苗原液 (I)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中國藥典》“吸附百白破聯合疫苗”中附錄I “百日咳疫苗原液制造及檢定要求”工作種子批經血清學試驗、皮膚壞死試驗、毒力試驗和效價測定后凍干保存。工作種子批菌種啟開后，接種于培養基，如改良包-姜培養基或活性炭半綜合培養基，于35 37°C培養不超過72小時，經純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液。(II)白喉菌種工作種子批傳代至產毒培養基種子管2 3代，再傳至產毒培養基培養制成生產用種子。采用培養罐液體培養，培養過程中嚴格控制雜菌污染。檢測培養物濾液，毒素效價不低于150Lf/ml時收獲。收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進行脫毒。脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素。(III)破傷風菌種工作種子批先在產毒培養基種子管中傳廣3代，再轉至產毒培養基制成生產用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經加深水解后的培養基作為生產用培養基。采用培養罐液本培養，培養過程應嚴格控制雜菌污染。檢測培養物濾液，毒素效價不低于40Lf/ml時收獲毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進行脫毒,制成類毒素，即為破傷風類毒素。(2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應為淺藍色或乳白色膠體懸液。將白喉類毒素、破傷風類毒素及無細胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細胞百白破聯合疫苗。二、b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗的制備(I)制備各單價疫苗原液(I) A群腦膜炎球菌結合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%, 2 一 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液。依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，既為A群腦膜炎結合物原液，于2 8°C保存；(II) C群腦膜炎球菌結合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液。依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜,反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，既為C群腦膜炎結合物原液，于2 8°C保存；(III)b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液。依據2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”中檢定要求對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應適宜時間后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入一定濃度碳二亞胺(EDAC)冰浴反應一定時間，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，既b型流感嗜血桿菌結合物原液，于2 8°C保存；(2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌多糖結合原液與b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖計)混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗。三.分裝將上述制備的吸附無細胞百白破聯合疫苗與b型流感嗜血桿菌_A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗分別分裝在預充式注射器與低硼硅西林瓶中再包裝至每人份市售獨 立包裝。四.成品檢定除水分測定外，按制品標示量加入吸附無細胞百白破復溶后進行其余各項檢定，其中檢測制品多糖含量時加入注射用水復溶后進行檢測。成品檢定如下I物理檢查I. I外觀凍干制劑應為白色疏松體，按標示量加入吸附無細胞百白破后應迅速復溶為白色混懸液，無搖之不散的異物。I. 2裝量差異依法檢查(2010版《中國藥典》三部，附錄I A)，裝量差異限度應(±15% οI. 3鑒別試驗采用免疫雙擴散法(2010版《中國藥典》三部，附錄VDI C)，本品應分別與A群、C群腦膜炎奈瑟氏菌、b型流感嗜血桿菌診斷血清和破傷風抗毒素形成明顯沉淀線。無細胞百日咳疫苗注射動物應產生抗體(同效力檢測)白喉類毒素采用小鼠一 Veix)細胞法。破傷風類毒素注射動物后應產生破傷風抗體(同效力檢測)；疫苗加入枸椽酸鈉或絮狀反應。2化學檢定2. I pH值應為5. 8 7. 5《中國藥典》三部，2010版附錄V A)2. 2游離多糖A群腦膜炎球菌和C群腦膜炎球菌、Hib游離多糖含量均應不高于20%。2. 3水分應不高于3. 0%(2010版《中國藥典》三部，附錄YD D)。2. 4多糖含量:A群腦膜炎球菌多糖采用鑰酸銨法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄νπ A)，C群腦膜炎球菌多糖采用間苯二酚顯色法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄VI C)，b型流感嗜血桿菌多糖采用鑰酸銨法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄YD Α)或核糖法(2010版《中華人民共和國藥典》三部附錄珊J)進行檢測。其中A群腦膜炎球菌多糖根據WHO規程規定的計算公式(A群多糖含量磷含量為1000 75 ;C群多糖含量唾液酸含量為100 :75)，b型流感嗜血桿菌多糖根據WHO規程規定的計算公式(Hib多糖含量核糖含量為100 84)和2010版《中華人民共和國藥典》三部提供的計算公式(Hib多糖含量核糖含量為I :0. 41)，按照《A、C群腦膜炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯合疫苗中各群多糖及游離多糖含量檢定方法》中的計算方法得出各群多糖含量。每I次人用劑量以多糖含量計算應不低于30 μ g (A群、C群多糖和Hib多糖各應不低于10 μ g)。裝量依法檢查(2010版《中國藥典》附錄I A),應不低于標示量。2. 5氯化鈉含量應為7. 5 — 9. 5g/L (2010版《中國藥典》附錄VII G)。2. 6氫氧化鋁含量應為1.0— I. 5mg/ml (2010版《中國藥典》附錄VII F)。2. 7硫柳汞含量應不高于O. lg/L (2010版《中國藥典》附錄VII B)。2.8游離甲醛含量應不高于0.28/1 (2010版《中國藥典》附錄VI L)2. 9戊二醛含量應小于O. 01g/L (2010版《中國藥典》附錄VI I)2. 10熱原檢查用無菌生理氯化鈉溶液將供試品稀釋成半成品濃度的1/50，依法檢查(2010版《中國藥典》三部附錄ΧΠ D)，符合規定。注射量按家兔體重Ikg注射lml。 3.效價測定3.1無細胞百日咳疫苗按2010版《中國藥典》“吸附百白破聯合疫苗”中附錄2進行。以適宜的稀釋倍數稀釋至第一個免疫劑量，再按5倍系列稀釋。免疫時間為21天。每I次人用劑量的免疫效價應不低于4. 0IU,且95%可信限的低限應不低于2. OIU0如達不到上述要求時可進行復試，但所有的有效試驗結果必須以幾何平均值(如用概率分析法時，應用加權幾何平均)來計算。達到上述要求即判為合格。3. 2白喉疫苗每I次人用劑量中白喉類毒素的免疫效價應不低于30IU(2010版《中國藥典》附錄XI C)。3. 3破傷風疫苗每I次人用劑量中破傷風類毒素的免疫效價應不低于40IU (附錄XI B)。4.無菌檢查依法檢查(附錄XII A)，應符合規定。5.特異性毒性檢查5. I無細胞百日咳疫苗按2010版《中國藥典》本品種附錄中2. 5項進行。5. 2白喉、破傷風疫苗用體重25(T350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2. 5ml，分兩側注射，每側I. 25ml，觀察30天。注射部位可有浸潤，經5 10天變成硬結，可能30天不完全吸收。在第10天，第20天，每30天稱體重，到期體重比注射前增加，局部無化膿、無壞死、無破傷風癥狀及無晚期麻痹癥者為合格。6.毒性逆轉試驗供試品置37°C 4周，按2010版《中國藥典》本品種附錄中2. 6項進行。檢測結果
權利要求
1.一種聯合疫苗，由以下組分(a)和組分(b)組成 (a)吸附無細胞百白破聯合疫苗； (b)b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗； (a)和(b)分別裝在分開的容器中。
2.根據權利要求I所述的聯合疫苗，其特征在于所述的(a)吸附無細胞百白破聯合疫苗是按以下方法制備的 (I)制備各單價疫苗原液 (1)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中國藥典》“吸附百白破聯合疫苗”中附錄1“百日咳疫苗原液制造及檢定要求”工作種子批經血清學試驗、皮膚壞死試驗、毒力試驗和效價測定后凍干保存，工作種子批菌種啟開后，接種于培養基，如改良包-姜培養基或活性炭半綜合培養基，于35 37°C培養不超過72小時，經純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中；采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液； (II)白喉菌種工作種子批傳代至產毒培養基種子管2 3代，再傳至產毒培養基培養制成生產用種子，采用培養罐液體培養，培養過程中嚴格控制雜菌污染，檢測培養物濾液，毒素效價不低于150Lf/ml時收獲，收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制，精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進行脫毒,脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素； (III)破傷風菌種工作種子批先在產毒培養基種子管中傳Γ3代，再轉至產毒培養基制成生產用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經加深水解后的培養基作為生產用培養基。采用培養罐液本培養，培養過程應嚴格控制雜菌污染，檢測培養物濾液，毒素效價不低于40Lf/ml時收獲毒素,毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進行脫毒,制成類毒素，即為破傷風類毒素； (2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化鋁原液應為淺藍色或乳白色膠體懸液，將白喉類毒素、破傷風類毒素及無細胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細胞百白破聯合疫苗。
3.根據權利要求I所述的聯合疫苗，其特征在于所述的(b)b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗是按以下方法制備的 (I)制備各單價疫苗原液 (I)A群腦膜炎球菌結合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；依據2010版《中國藥典》三部中“A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存； (II)C群腦膜炎球菌結合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌·或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存； (III)b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”中檢定要求對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入一定濃度碳二亞胺(EDAC)冰浴反應一定時間，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液，于疒8°C保存； (2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌多糖結合原液與b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液1:1:1 (w/w,以多糖計)混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗。
4.權利要求I所述的聯合疫苗的制備方法，包括以下步驟 步驟一制備吸附無細胞百白破聯合疫苗 (I)制備各單價疫苗原液 (1)百日咳菌種工作種子批啟開后，接種于培養基，如改良包-姜培養基或活性炭半綜合培養基，于35 37°C培養不超過72小時，經純菌檢查后收集菌體，混懸于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用終濃度小于O. 1%甲醛溶液殺菌，經殺菌檢查后，即得百日咳疫苗原液； (II)白喉菌種工作種子批傳代至產毒培養基種子管2 3代，再傳至產毒培養基培養制成生產用種子。采用培養罐液體培養，培養過程中嚴格控制雜菌污染。檢測培養物濾液，毒素效價不低于150Lf/ml時收獲。收獲后精制，可采用硫酸銨、活性炭二段鹽析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C進行脫毒。脫毒到期的類毒素即為白喉類毒素； (III)破傷風菌種工作種子批先在產毒培養基種子管中傳廣3代，再轉至產毒培養基制成生產用種子。采用酪蛋白、黃豆蛋白、牛肉等蛋白經加深水解后的培養基作為生產用培養基。采用培養罐液本培養，培養過程應嚴格控制雜菌污染。檢測培養物濾液，毒素效價不低于40Lf/ml時收獲毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C進行脫毒,制成類毒素，即為破傷風類毒素； (2)合并及稀釋配制氫氧化鋁佐劑，采用三氯化鋁加氫氧化鈉法，配制成的氫氧化招原液應為淺藍色或乳白色膠體懸液。將白喉類毒素、破傷風類毒素及無細胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀釋的氫氧化鋁佐劑中，用NaOH調pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附無細胞百白破聯合疫苗； 步驟二 制備b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗 (I)制備各單價疫苗原液 (I)A群腦膜炎球菌結合疫苗原液:A群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%, 2 一 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得A群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存； (II)C群腦膜炎球菌結合疫苗原液C群腦膜炎球菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，加入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度759Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液；· 依據2010版《中國藥典》三部中“Α群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”中檢定要求，對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應6-60分鐘后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量的碳二亞胺(EDAC)冰浴反應I 一 4小時，用O. 2Μ的NaCl溶液透析過夜，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得C群腦膜炎球菌結合疫苗原液，于2l°C保存； (III)b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液b型流感嗜血桿菌工作種子批采用培養罐液體培養，于對數生長期后期或靜止期前期終止培養。取樣進行菌液濃度測定、純菌檢查，合格后進行殺菌，可在收獲的培養液中加入甲醛溶液殺菌或采用加熱等適宜方法殺菌；將已殺菌的培養液離心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，力口入乙醇至終濃度25%，2 — 8°C靜置I 一 3小時或過夜，離心收集上清；于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮洗滌各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達l(T20mg/ml ；按I :2容量用冷酚(IOOg結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度75°/Γ80% ;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙銅各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得純化多糖原液； 依據2010版《中國藥典》三部中“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”中檢定要求對多糖進行檢定，多糖原液經溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反應適宜時間后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超濾或透析等方法；取樣檢定合格后，將多糖-AH衍生物與破傷風類毒素等質量混合，然后加入過量碳二亞胺(EDAC)冰浴反應1-4小時，用O. 2M的NaCl溶液透析過夜或超濾，反應物經Sepharose 4FF層析純化,收集洗脫峰處的結合物，除菌過濾，即得b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液，于疒8°C保存； (2)合并凍干將A、C群腦膜炎球菌結合疫苗原液與b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液1:1:1 (w/w,以多糖計)混勻后，加入乳糖或甘氨酸分裝凍干，即得到b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗； 步驟三分裝將上述制備的吸附無細胞百白破聯合疫苗與b型流感嗜血桿菌-A、c群腦膜炎球菌聯合疫苗分別分裝在預充式注射器與低硼硅西林瓶中。
5.根據權利要求I所述的疫苗，其特征在于，白喉類毒素、破傷風類毒素、百日咳抗原被吸附到氫氧化鋁佐劑上。
6.根據權利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述組分(a)可包含氫氧化鋁和/或磷酸招佐劑。
7.根據權利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述白喉類毒素與破傷風類毒素的比例在2 :1和3 :1之間，以Lf單位測量。
8.根據權利要求I所述疫苗，其特征在于，所述組分(b)中腦膜炎球菌莢膜多糖與b型流感嗜血桿菌莢膜多糖為各自偶聯至載體蛋白上，如偶聯至破傷風類毒素。
9.根據權利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的單位劑量包含每種偶聯物4一16Pg。
10.根據權利要求I所述疫苗，其特征在于，所述組分(b)包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A和C的多糖。
11.根據權利要求I所疫苗，其特征在于，所述組分(b)的偶聯物，其多糖與蛋白的質量比為O. 3至I. 2之間。
12.根據權利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述組分(b)中A群、C群血清型多糖偶聯物比例為I :1。
全文摘要
本發明提供了一種吸附無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗，使其具有安全、有效、可控及一針防多病的特點，并符合2010版《中國藥典》三部“吸附無細胞百白破聯合疫苗”“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”“A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗”及擬定“吸附無細胞百白破/b型流感嗜血桿菌-A、C群腦膜炎球菌聯合疫苗制造與檢定規程”的相關要求，達到了可投入實際應用的效果。
文檔編號A61P31/04GK102813917SQ20121029554
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者楊曉明, 魏樹源, 段凱, 薛紅剛, 李新國, 項美娟, 盧佳麗 申請人:武漢生物制品研究所有限責任公司