專利名稱：脫氫水飛薊賓在制備抗肺癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域。具體而言，本發明涉及7位和20位 異戊烯基取代的脫氫水飛薊賓雙醚衍生物的制備及其用于制備抗腫 瘤藥物的用途，該化合物具有體外顯著抑制人肺癌細胞A549的活性， 其抑制活性超過陽性對照用藥順鉑；同時該水飛薊賓雙醚對人口腔表 皮癌KB細胞也表現出強效抑制作用。以上藥效學結果表明該脫氫水 飛薊賓雙醚或其可藥用鹽可以預期用于制備防治腫瘤性疾病特別是 口腔表皮癌及肺癌藥物的用途。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病和多發病。根據世界衛生 組織報告，全世界50億人口中，每年新發病例約900萬例，因腫瘤 而死亡者達700萬人，且每年還有增加的趨勢。藥物治療在惡性腫瘤 的三大療法中占有重要地位。近年來，隨著分子腫瘤學、分子藥理學 的不斷發展，以及對腫瘤本質的闡明，大規模、快速篩選組合化學、 基因工程等先進技術的發明和應用加速了藥物開發進程。在相當一段 時期，傳統細胞毒性藥物仍將是腫瘤藥物治療的主體，針對機制的多 環節作用的新型抗腫瘤藥物成為目前國內外關注的熱點。
水飛薊是少數幾個在臨床上廣泛應用的天然藥物之一。Silymarin (水飛薊素)和Silybin (水飛薊賓)都是菊科植物水飛薊&7>^m (L.)Gaertn中提取得到的物質。水飛薊素已收入我國藥典。 水飛薊素為水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊丁等黃酮木質素類化合物組 成的混合物，其中水飛薊賓含量最高。三十多年的臨床實驗證明該藥 具有確切的療效和低毒性(參閱Flora K.等人，^m. / GaWrae"&ro/, 1998， 93， 139-143; Sailer R.等人，Z>，， 2001, 61(14)， 2035-2063)。 雖然有報道水飛薊素和水飛薊賓在治療癌癥方面的應用[Ramasamy 等，C""cw丄etera， 2008， 352]，但其抗腫瘤作用的主要機理在于各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進而 引起腫瘤，而水飛薊賓作為一個有效的抗自由基物質顯示出其預防和 治療腫瘤的作用。
水飛薊賓類化合物具有確切的療效，故而以此天然藥物為先導化 合物(Lead compound)進一步開發，尋找水飛薊賓類新的衍生物， 使其能夠具有更高或者更新的抗腫瘤藥理活性，以期獲取自主知識產 權的抗腫瘤新藥，實屬必要。然而，雖然說至今為止水飛薊素和水飛 薊賓類文獻報道已經超過1500篇，但是以水飛薊賓為母體化合物構 建出的衍生物及相關活性報道并不多見。我們前期報道了在水飛薊賓 的B環和E換上進行了一系列衍生物的合成，發現在B環上引入甲 氧基，可顯著提高其清除超氧陰離子自由基的活性[楊雷香，趙昱等， "Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel Silybin Analogue", /owrwa/ q/"五"2y膨/"/z/6Wow awd MWc/wa/ C7zew/s/77， 2006: 21(4), 399-404.]。捷克同行在水飛薊素和水飛薊賓研究領域做出了不 少研究成果，他們于2006年發表的文章中敘述了在水飛薊賓的幾個 羥基上引入甲氧基可不同程度提高水飛薊賓的抗腫瘤活性，但引入甲 氧基并不嫩提高化合物的細胞毒活性[D2ub汰，P.等， C7ze附.，2006, 14，3793]。法國研究者也報道了在水飛薊賓A環上的C-6 及C-8位引入異戊烯基(prenyl)或香葉基(gemnyl)后，可以改變 水飛薊賓的抗腫瘤活性[Maitrejean等，C/zew. 2000, 10, 157-160]。但是，所有文獻均未曾報道直接在7、 20位羥基氧原子上 引入異戊烯基等含不飽和碳鍵基團后對水飛薊賓和/或脫氫水飛薊賓 的抗腫瘤活性影響。
常見的細胞毒類抗腫瘤藥分為如下幾類(1)拓撲異構酶抑制 劑如喜樹堿類化合物及其半合成衍生物伊立替康和拓撲替康；高喜樹 堿類化合物(homocamptothecin， HCPT)，氟替康(diflom otecan) 等。(2)胸苷酸合成酶抑制劑如雷替曲塞、AG337,多靶點抗葉酸 劑(MTA)培美曲塞(pemetrexed，商品名Alimta)等。(3)鉑類
抗腫瘤藥物如順鉑和第三代鉑類抗腫瘤藥物如奧沙利鉑、萘達鉑和賽 特鉬(satrapiatin， JM-216)。均說明細胞毒類藥物仍然具有較為廣
泛的市場和確定的療效。鑒于至今尚無相關文獻報道增強了引入上述親脂性基團后的脫氫水飛薊賓雙醚類是否能提高其抗腫瘤活性，本發 明采用體外細胞毒藥效學模型對我們設計合成出的化合物進行了抗 腫瘤活性檢驗和藥效學評價。
藥理試驗結果證實，我們制備得到的7位和20位異戊烯基取代 的脫氫水飛薊賓雙醚對于上述體外培養的兩種人腫瘤細胞株(口腔上 皮癌細胞KB和人肺癌細胞A549)具有顯著的生長抑制活性，且其 活性明顯強于水飛薊賓和脫氫水飛薊賓，說明該7位和20位取代的 脫氫水飛薊賓異戊烯基雙醚或其可藥用鹽具有可期待作為防治相關 腫瘤性疾病藥物之用途，由此完成本發明。

發明內容
本發明的目的是提供了具有式(I)所示結構的7位和20位異戊 烯基取代的脫氫水飛薊賓雙醚化合物2-{2，3-二氫-3-[4-(2-甲基-2-烯 丁基氧基)-3-甲氧基苯基]-2-羥甲基-l，4-苯并二氧六環-6+7-(2-甲基 -2-烯丁基氧基)-3，5,-二羥基-4//-1-苯并吡喃-4-酮，也即7,20~雙(2— 甲基-2-丁烯基)-脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽用于制備抗腫瘤藥物 的用途
其中，10， ll位同時為R構型或同時為S構型。
本發明還提供了一種用于防治腫瘤性疾病的藥物或藥物組合物， 其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示結構的7,20"雙(2-甲基-2-丁烯基)-脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽和可藥用輔料。
此外，本發明也提供了一種制備式(I)化合物的方法，其特征 是水飛薊賓在堿催化下與過量的異戊烯基鹵素反應制備而得；反應 溫度為20°C至200°C，反應時間為10分鐘至48小時；其中堿是無 機堿或有機堿，異戊烯基鹵素是指異戊烯基溴；過量是指參與反應的 異戊烯基溴的摩爾數是參與同一反應的水飛薊賓之摩爾數的三倍及三倍以上；水飛薊賓是指非對映體的水飛薊賓A或水飛薊賓B或它 們的混合物。
本發明所述7,20-雙(2-甲基-2-烯丁基)-脫氫水飛薊賓醚具有 重要的生物活性，體外試驗表明其對于體外培養人口腔上皮癌細胞 (KB)、人肺癌細胞(A549)之體外增值均具有強效的生長抑制活 性，可期待作為防治相關腫瘤性疾病藥物的用途。
本發明的7，20-雙(2-甲基-2-烯丁基)-脫氫水飛薊賓醚或其可 藥用鹽還可以與已上市的細胞毒類抗腫瘤藥物如喜樹堿類化合物及 其半合成衍生物伊立替康和拓撲替康；高喜樹堿類化合物(homocam ptothecin， HCPT)，氟替康(diflom otecan);胸苷酸合成酶抑制劑 如雷替曲塞、AG337，多靶點抗葉酸劑(MTA)培美曲塞(pemetrexed， 商品名Alimta)等；鉑類抗腫瘤藥物如順鉑和第三代鉑類抗腫瘤藥物 如奧沙利鉑、萘達鉑和賽特鉑(satrapiatin， JM-216);以及其他機 制的抗腫瘤藥物如紫杉醇(Paclitaxel)類、足葉乙苷(Etoposide)、 脫氧胞昔類吉西他濱(Gemcitabine)、長春新堿類如Vinorebine等聯 合使用，制備得到具有腫瘤生長抑制作用的抗腫瘤組合物，可用于治 療多種腫瘤疾病。
7，20-雙(2-甲基-2-烯丁基)-脫氫水飛薊賓或其可藥用鹽可以與 藥學上常用的輔料或載體結合，制備得到具有抗腫瘤用途的藥物組合 物。上述藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊、貼片、皮下植埋 劑等劑型，或其他采用公知理論和技術制備的控釋、緩釋劑型以及納 米制劑。
本發明的有益之處在于提供了 7位和20位取代的脫氫水飛薊 賓異戊烯基雙醚在制備防治腫瘤疾病創新藥物方面的新用途。對于開 發創新性抗腫瘤藥物提供了物質基礎，具有潛在的社會效益和經濟效 益。本發明之式(I)化合物來源于天然藥物，經半合成制備而得。 其來源易得、價廉；合成方法簡便，成本低，污染小，利于節能減排 條件下的大規模生產。產業化前景明確。
具體實施例方式
為了更好地理解本發明的實質，下面首先用實施例的形式說明化合物制備的過程，實施例給出了化合物的部分物理和化學及波譜學數 據。必須說明，本發明的實施例是用于說明本發明而不是對本發明的 限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬于本發明要求 保護的范圍。
實施例1:化合物7,20-雙(2—甲基-2-烯丁基)-脫氫水飛薊賓醚的制 備
在干燥的反應瓶中，0.48克水飛薊賓溶于6毫升DMF中，加入 0.552克碳酸鉀，攪拌10分鐘使溶解完全。緩慢滴加異戊烯基溴0.33 克，攪拌10分鐘，再加熱回流反應2小時。靜置冷卻，加入20毫升 蒸餾水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有機層，10毫升 蒸餾水洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得棕黃色粗品，經200 300 目硅膠(20克)柱層析，氯仿:醋酸乙酯:醋酸=7:1:0.1洗脫，得到黃 色晶體220毫克。收率35.6%。
式(I)化合物Rf (氯仿:醋酸乙酯:醋酸=7:1:0.5) 0.49;核磁共 振氫譜& NMR (400 MHz，氘代氯仿)S: 1.75 (寬單峰，6H， 2xC//3)， 1.79 (寬單峰，3H, C7/3)， 1.81 (寬單峰，3H， C//3)， 3.60 (多重峰，1H， H畫23a)， 3.75 (多重峰，1H, H-23b), 3.85 (單峰，3H， OC//3)， 4.15 (多重峰, 1H, H-IO), 4.55~4.63 (多重峰，4H， H-l' & H-l"), 5.02 (雙峰，J = 8.0 Hz， 1H， H—11)， 5.44~5.53 (多重峰，2H， H-2' & H-2")， 6.35 (雙峰，J = 1.6 Hz， m, H—6), 6.42 (寬單峰，1H， H-8)， 6.92-7.01 (多重峰，3H，芳香 環Ar—H—16， H—18 & H—22), 7.08 (雙峰，J = 8.8 Hz， 1H， H—21), 7.75 (寬 單峰，1H， H—13), 7.79 (雙峰,J = 8.0 Hz, 1H, H—15)， 12.69 (單峰，1H, 5-OH);電噴霧質譜ESI-MS:617(M+H)+。實施例2:式(I)化合物對口腔上皮癌細胞的細胞毒活性 2.1實驗材料與樣品
2丄1細胞口腔上皮癌細胞(KB)購自中科院上海細胞所。 2丄2實驗試劑
2.1.2.1 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)購自Amresco公司；
212.2RPMI 1640培養基、小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有 限公司；
2丄2.3青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團有限公司生產；
2丄2.4其它試劑如二甲亞砜等均為國產分析純，購自杭州華東醫藥
試劑有限公司。
2丄3實驗儀器
2.1.3.1酶標儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；
2丄3.2立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫
療器材廠；
2丄3.3超純水系統UPWS-I-60D型，杭州永潔達凈化科技有限公司；
2.1.3.4除菌過濾器Sterifil500型，Millipore公司；
2丄3.5氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫療儀器廠；
2丄3.6C02細胞培養箱MMM，德國公司；
2丄3.7倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。
2.2細胞培養口腔上皮癌細胞(KB)細胞用RPMI 1640培養基培 養，培養基中含10%的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的 鏈霉素。細胞以每孔5乂103的濃度加入到96孔板中，在37r含50/^ C02潮濕空氣的培養箱中培養24小時。
2.3細胞存活率(細胞毒性)的測定細胞存活率的測定用改良MTT 法。細胞經過24小時的孵育后，分別將新配的化合物I的二甲亞砜 溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物最終濃度分別為100微 克/毫升，33.3微克/毫升，11.1微克/毫升和3.7微克/毫升。72小時后， 加入10微升MTT (5微克/毫升)的磷酸鹽緩沖液，再繼續在37'C培養4小時后，離心5分鐘除去未轉化的MTT，每孔中加入200微升二甲亞砜，以溶解還原的MTT晶體甲臜(formazan)，所形成的formazan用酶標儀在570nm波長下比色，細胞存活率由樣品相對于對照品的比值計算。其中測試化合物對KB細胞半抑制濃度IC5。由劑量效應曲線得到。
2.4實驗結果式(I)化合物對KB細胞的IC5o為6.7土1.3nM(微摩爾/升)；水飛薊賓對KB細胞的IC5。為103.5 ± 16.2 脫氫水飛薊賓對KB細胞的IC5Q為29.2 ± 5.1 而陽性對照順鉑對KB細胞的IC5o為2.1士0.8 |oM。
2.5實驗結論KB細胞是測試化合物對腫瘤細胞的細胞毒性的有效工具和評價指標。本實驗表明7,20-雙(2-甲基-2-烯丁基)-脫氫水飛薊賓醚對KB細胞具有較強的細胞毒性，其活性優于水飛薊賓和脫氫水飛薊賓，顯示其預想不到的效果，因而有可能發展成為新的具有抗口腔上皮癌及相關腫瘤作用的藥物。
實施例3:式(I)化合物對人肺癌細胞的細胞毒活性3.1實驗材料與樣品
3丄1細胞人肺癌細胞(A549)購自中科院上海細胞所。3丄2實驗試劑
3.1.2.1 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)國2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)購自Amresco公司；
312.2RPMI 1640培養基、小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；
3丄2.3青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團有限公司生產；
3丄2.4其它試劑如二甲亞砜等均為國產分析純，購自杭州華東醫藥
試劑有限公司。
3丄3實驗儀器
3.1.3.1酶標儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；
3丄3.2立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫療器材廠；
3.1.3.3超純水系統UPWS小60D型，杭州永潔達凈化科技有限公司；
3.1.3.4除菌過濾器Sterifi1500型，Millipore公司；
3丄3.5氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫療儀器廠；
3丄3.6C02細胞培養箱MMM，德國公司；
3丄3.7倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。
3.2細胞培養人肺癌細胞(A549)用RPMI 1640培養基培養，培養基中含10%的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的鏈霉素。細胞以每孔5乂103的濃度加入到96孔板中，在37'C含5%032潮濕空氣的培養箱中培養24小時。
3.3細胞存活率(細胞毒性)的測定細胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法如實施例2。其中測試化合物對A549細胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到。
3.4實驗結果化合物I對A549細胞的IC5o為11.6 ± 2.2 (iM (微摩爾/升)；水飛薊賓對A549細胞的IC5o大于200 脫氫水飛薊賓對A549細胞的IC5o為42.9 ± 7.3 ^M;而陽性對照順鉑對A549細胞的ICso為40.8 ± 8.6 pM。
3.5實驗結論A549細胞是測試化合物對肺部腫瘤細胞毒性的有效工具和評價指標。本實驗表明7，20-雙(2-甲基-2-烯丁基)-脫氫水飛薊賓醚對A549細胞具有較強的細胞毒性，其活性除優于水飛薊賓和脫氫水飛薊賓，甚至強于陽性對照藥物順鉑，顯示其預想不到的效果，因而有可能發展成為新的具有抗肺癌作用的藥物。
權利要求
1.具有式(I)所示結構的7位和20位異戊烯基取代的脫氫水飛薊賓雙醚化合物或其可藥用鹽用于制備抗腫瘤藥物的用途； id="icf0001" file="A2009100998090002C1.tif" wi="88" he="36" top= "43" left = "47" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>式(I)其中，10，11位同時為R構型或同時為S構型；式(I)化合物的名稱為7，20-雙(2-甲基-2-丁烯基)-脫氫水飛薊賓醚。
2. 根據權利要求l所述的式(I)化合物的抗腫瘤藥物用途，其特征 在于所述的腫瘤是指口腔表皮癌或肺癌。
3. 根據權利要求1所述的式(I)化合物在制備肺癌細胞生長抑制劑 中的應用。
4. 根據權利要求1所述的式(I)化合物在制備口腔上皮癌細胞生長 抑制劑中的應用。
5. —種用于防治腫瘤性疾病的藥物或藥物組合物，其含有治療有效 量的作為活性成分的式(I)所示結構的7，20-雙(2-甲基-2-丁烯基) -脫氫水飛薊賓醚或其可藥用鹽和可藥用輔料。
全文摘要
本發明涉及脫氫水飛薊賓在制備抗肺癌藥物中的應用，具體而言，本發明涉及7位和20位異戊烯基取代的脫氫水飛薊賓雙醚衍生物的抗腫瘤藥物用途，該化合物具有體外顯著抑制人肺癌細胞A549的活性；其半數抑制濃度為11.6±1.6微摩爾/升，超過陽性對照用藥順鉑(半數抑制濃度為40.8±5.2微摩爾/升)三倍以上；該水飛薊賓雙醚同時還對人口腔表皮癌KB細胞顯示出強效抑制作用，其半數抑制濃度為6.7±1.3微摩爾/升。藥效學結果表明該脫氫水飛薊賓雙醚或其可藥用鹽可以預期用于制備防治腫瘤性疾病特別是肺癌藥物的用途。
文檔編號A61P35/00GK101590035SQ200910099809
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月22日 優先權日2009年6月22日
發明者馮玉冰, 巫秀美, 李校堃, 驊 白, 佳 瞿, 昱 趙, 黃可新, 龔景旭 申請人:溫州醫學院;李校堃