專利名稱：人工骨骼材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于骨損傷修復的人工骨骼材料。
背景技術：
近年，整形外科等領域中普遍使用人工骨骼材料進行對各種疾患產生的骨損傷進行修復。作為人工骨骼材料，主要使用磷酸二氫鈣類陶瓷。磷酸二氫鈣類陶瓷材料具有優異生物相容性、良好的骨傳導能力，并有作為骨形成基礎的作用。但骨損傷嚴重時，單獨使用磷酸二氫鈣類陶瓷材料很難進行修復，所以，對于這樣的病例只能移植自身的骨骼，但受采骨量限制，很難對骨損傷進行修復。
基于這樣的背景，骨損傷嚴重的病例，期待著具有更高骨形成能力的材料，即具有骨誘導活性的移植用材料。以此為背景，以上述磷酸二氫鈣類陶瓷材料為載體，培養骨髓細胞，進行了植入細胞型人工骨骼材料的研究。
吉川等將人培養骨髓細胞和多孔羥磷灰石混合，在骨形成培養基中培養3周后，將其移植到裸鼠腹腔內，2個月后摘除，進行組織學評價，證明骨形成明顯。(日整會志，73(3)，S672)。
在多孔陶瓷中植入培養骨髓細胞的人工骨骼存在如下課題。
首先，要使骨髓細胞侵入到多孔陶瓷的中心。使用的多孔陶瓷的型號變大時，骨髓細胞很難進入到中心部分。另外，即使細胞侵入到多孔陶瓷的中心部分，血管也不能到達中心部分，氧分壓低，還有不能發揮作為成骨細胞的功能的問題。
其次，作為植入細胞的載體的多孔材料存在如下課題。具體如下。成為載體的材料需要滿足如下條件載體必需有高的生物相容性，并且不影響培養細胞的活性，還要有骨傳導能力，并且在移植后進行骨形成的同時載體本身可被吸收。作為載體的骨膠原或聚乳酸乙醇酸等具有生物降解能力，雖然能滿足作為載體條件的分解吸收性，但是骨傳導能力差，所以不是優選的材料。
另一方面，磷酸二氫鈣類陶瓷的骨傳導能力優異，從這點出發優選這類材料。但是最常見的作為人工骨骼的HAP的磷酸二氫鈣很難在生物體內被吸收，因此，從吸收性的角度出發，則不是優選的材料。而β-磷酸鈣(β-TCP)具有良好的吸收性，并且具有骨傳導能力，是作為載體的最理想材料。
從所述觀點出發，以往β-TCP單獨作為骨補充材料使用。但是，Altermatt等在出版物(Eur.J.Pediatr.Surg.2，180～182)中報道了經觀察，多孔β-TCP應用于骨囊腫時，作為材料，在補充部位最長可以存在7年。β-TCP雖然具有可被吸收的性質，但還有長期存在的情況，β-TCP不是根本意義上的理想材料。
實際使用中β-TCP的純度也是個問題。β-TCP一般的制作方法有干式的通過使碳酸鈣和磷酸鈣發生固相反應的方法，濕式的使鈣離子和磷離子反應的方法。
但是，干式方法因為反應不是均質的，殘留一定的未反應物，生成的粉末缺乏燒結特性。濕式方法中必需精確的控制溫度和pH，Ca和P的比例與化學理論量略有不同就會含有微量的副產物。原料的性質受制造工藝的影響很大，其制造工藝差會導致在使用階段出現所不希望的結果，而以往對所述影響完全沒有研究。并且形成多孔β-TCP的氣孔形狀也是影響骨傳導能力和吸收性的因素。

發明內容
基于以上事實，本發明的目的是通過復合β-TCP和培養骨髓細胞，提供促進骨形成的理想人工骨骼材料。
為了達到上述目的，權利要求1的發明的人工骨骼材料的特征為，在β-磷酸鈣形成的多孔陶瓷的內部植入骨髓細胞。
權利要求2的發明是如權利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細胞中還復合了提供骨形成的細胞增殖因子。
權利要求3的發明是如權利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷的氣孔率為60～90％，具有多個氣孔連同的50～1000μm大小的巨型氣孔和2μm以下的微型氣孔。
權利要求4的發明是如權利要求1或3所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷使用通過機械化學方法合成的β-磷酸鈣粉末作為原料，成形后燒結處理形成。
權利要求5的發明是如權利要求1或2所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細胞是從患者身上采取培養的培養細胞。
權利要求6的發明是如權利要求5所述的人工骨骼材料，其特征為，在培養中對所述培養細胞給予電或/和機械刺激。
權利要求7的發明是如權利要求5或6所述的人工骨骼材料，其特征為，所述培養細胞通過下述(a)～(c)中的至少一種方法或組合的方法播種到多孔陶瓷的內部。
(a)減壓或加壓下播種培養細胞。
(b)反復減壓和加壓播種培養細胞。
(b)利用離心力播種培養細胞。
具體實施形式本發明的人工骨骼材料是，通過播種，在由β-TCP形成的陶瓷內部植入骨髓細胞的物質。多孔陶瓷的形狀可以是塊狀或顆粒狀。
使細胞侵入到多孔陶瓷的中心部分過程中，向多孔陶瓷材料播種培養骨髓細胞時，為了有效地播種，可以在減壓或加壓的情況下進行，或在反復減壓和加壓的情況下進行，或利用離心力的作用進行。這樣可以使骨髓細胞進入到多孔陶瓷的中心部分。此時，組合幾個所述的方法可以更加有效。
另外，通過細胞培養中施加電或機械刺激，例如施加電場、增加各向同性壓力，增加沖擊波等，可以增加細胞的增殖性，從而可以維持細胞活性。
通過將VEGF等血管新生的誘導因子復合在骨髓細胞上，使多孔陶瓷的內部的血管新生成為可能。此時，優選通過使用VEGF的表達載體導入基因進行復合。
另外，除了培養細胞，不僅復合VEGF，還復合提供骨形成的細胞增殖因子，從而可以更好的實現骨形成。例如，通過使用BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF等提供骨形成的細胞增殖因子可以確保骨形成。
復合β-TCP形成的多孔陶瓷和培養骨髓細胞的人骨骼材料以促進骨形成。該人工骨骼材料中，作為β-TCP，使用高純度的具有優異骨傳導能力和吸收性的材料。
由β-TCP形成的多孔陶瓷具有多個氣孔連通的巨型氣孔和比此巨型氣孔小的微型氣孔，其氣孔率優選60～90％。作為巨型氣孔，大小優選在50～1000μm，更優選在100～500μm。作為巨型氣孔，優選容積率為全部氣孔的30～70％左右。該巨型氣孔可以提供骨髓細胞向陶瓷內侵入和血管新生的空間。
微型氣孔優選大小在2μm以下，更優選在1μm以下。另外，微型氣孔優選容積率占全氣孔的10～40％左右。該微型氣孔具有促進使吸收容易的化學作用。
高純度的β-TCP是利用濕式粉碎的機械化學法制造的，其可以作為用于骨組織的代替材料的材料成分。所述機械化學法具體如下所述，稱取碳酸鈣和磷酸氫鈣二水合物，Ca和P的摩爾比為1.5，采用濕式粉碎，將該粉末在球磨機中粉碎，得到泥漿狀混合物，將該泥漿狀混合物干燥，然后在720℃～900℃焙燒，得到β-TCP。通過該方法可以在原料的稱量上控制Ca和P的比例，得到純度高且燒結性優異的β-TCP。
由具有優異的骨傳導能力和吸收性的β-TCP形成的多孔陶瓷的方法如下所述。向通過濕式粉碎方法得到的β-TCP粉末中加入表面活性劑(散凝劑)，濕式發泡成型后干燥處理，于950℃～1050℃焙燒成多孔體。通過該方法可以得到氣孔率為60～90％，具有多個氣孔連通的50～1000μm大小的巨型氣孔，其容積率為總氣孔的30～70％，并且具有2μm以下的微型氣孔，其容積率為總氣孔的10～40％的多孔陶瓷。
復合由上述的β-TCP形成的多孔陶瓷和培養骨髓細胞制成的人工骨骼材料可以作為很好的促進骨形成的人工骨骼材料。
實施例1稱取摩爾比為1∶2的碳酸鈣粉末和磷酸氫鈣二水合物，并與純水一起投入到球磨機缽中，用球磨機混合粉碎約1天。在約80℃干燥得到的泥漿狀混合物，然后在750℃焙燒。得到的粉末是燒結性優異、純度高的β-TCP陶瓷。
向該粉末中加入純水和丙烯酸銨類散凝劑與聚氧乙烯烷基苯基醚類表面活性劑，混合攪拌，配制發泡泥漿。干燥該發泡泥漿，然后在150℃焙燒，得到β-TCP多孔陶瓷。該多孔陶瓷的氣孔率為75％，氣孔孔徑分布在100～500μm和1～0.1μm的2個范圍。
實施例2以實施例1制作的β-TCP多孔陶瓷作為基礎材料，播種來源于骨髓的成骨細胞的第一代培養細胞，體外培養，形成骨形成種子的骨組織，植入生物體，從植入的組織形成大量的骨組織。具體方法如下所述。
采取骨髓細胞，接種到培養瓶中，MEM培養基中加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)，5％CO2下，在37℃培養10天左右。然后通過胰蛋白酶處理，從培養瓶中分離細胞，接著播種到由β-TCP形成的塊狀多孔陶瓷中。培養基使用加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)的MEM培養基。
對5mm×5mm×5mm的塊狀多孔陶瓷播種時，細胞濃度為1cc的培養基中含有100萬個或100萬個以上的細胞。在5％CO2下，于37℃恒溫培養1-3小時后，更換培養基，在加有10-15％FBS(牛胎兒血清)的MEM培養基的基礎上追加10-8M的地塞米松、10mM的β-甘油磷酸酯、50μg/ml的抗壞血酸，每2日進行一次追加，在5％CO2下，于37℃恒溫培養2周左右。然后將各多孔陶瓷塊植入生物體內。
其后，從fisher大鼠的大腿骨采取骨髓液，用上述方法培養該骨髓液，播種到由β-TCP多孔陶瓷形成的塊料上，培養2周后，植入到其他的fisher大鼠的皮下，3周后取出。通過HE染色研究證明骨形成良好。
實施例3使實施例1制作的β-TCP多孔陶瓷上吸附細胞增殖因子進行播種。作為細胞增殖因子，分別使用VEGF、BMP、FGF、FGF-β、IGF、PDGF。體外培養，形成骨形成種子的骨組織，植入生物體，從植入的組織形成大量的骨組織。具體方法如下所述。
分別采取上述細胞增殖因子，接種到培養瓶中，MEM培養基中加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)，在5％CO2下，在37℃培養10天左右。然后通過胰蛋白酶處理，從培養瓶中分離細胞，接著播種到由β-TCP形成的塊狀多孔陶瓷中。培養基使用加入10～15％的FBS(牛胎兒血清)的MEM培養基。
播種時，各細胞增殖因子的播種方法分別采用減壓下播種、加壓下播種和反復減壓加壓下播種的方法，同時采用利用離心力作用的播種方法，制作各播種條件的試驗體。
對5mm×5mm×5mm的塊狀多孔陶瓷播種時，細胞增殖因子的濃度為1cc的培養基中含有100萬個或100萬個以上的細胞。在5％CO2下，于37℃恒溫培養1-3小時后，更換培養基，在加有10-15％FBS(牛胎兒血清)的MEM培養基的基礎上追加10-8M的地塞米松、10mM的β-甘油磷酸酯、50μg/ml的抗壞血酸，每2日進行一次追加，在5％CO2下，于37℃恒溫培養2周左右。然后將各多孔陶瓷塊植入生物體內。
其后，從fisher大鼠的大腿骨采取骨髓液，用上述方法培養該骨髓液，播種到由β-TCP多孔陶瓷形成的塊料上，培養2周后，植入到其他的fisher大鼠的皮下，3周后取出。通過HE染色研究證明骨形成良好。
如上所述，通過本發明，在β-TCP多孔陶瓷中植入骨髓細胞可以提供能夠很好地促進骨形成的人工骨骼材料。另外，通過各向同性壓力等機械刺激或復合VEGF等細胞增殖因子，可以確保骨形成，從而進一步提高實用性。
權利要求
1.一種人工骨骼材料，其特征為，在β-磷酸鈣形成的多孔陶瓷的內部植入骨髓細胞。
2.如權利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細胞中還復合了提供骨形成的細胞增殖因子。
3.如權利要求1所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷的氣孔率為60～90％，具有多個氣孔連通的50～1000μm大小的巨型氣孔和2μm以下的微型氣孔。
4.如權利要求1或3所述的人工骨骼材料，其特征為，所述多孔陶瓷使用通過機械化學方法合成的β-磷酸鈣粉末作為原料，成形后燒結處理形成。
5.如權利要求1或2所述的人工骨骼材料，其特征為，所述骨髓細胞是從患者身體采取培養的培養細胞。
6.如權利要求5所述的人工骨骼材料，其特征為，在培養中對所述培養細胞給予電或/和機械刺激。
7.如權利要求5或6所述的人工骨骼材料，其特征為，所述培養細胞通過下述(a)～(c)中的至少一種方法或組合的方法播種到多孔陶瓷的內部(c)減壓或加壓下播種培養細胞；(b)反復減壓和加壓播種培養細胞；(d)利用離心力播種培養細胞。
全文摘要
在由β－磷酸鈣形成的多孔陶瓷內部植入骨髓細胞，提供人體相容性良好的有利于骨形成的人工骨骼材料。
文檔編號A61L27/56GK1501818SQ02807099
公開日2004年6月2日 申請日期2002年3月22日 優先權日2001年3月23日
發明者袴塚康治, 入江洋之, 井上晃, 増渕良司, 岡部洋, 植村壽公, 之, 公, 司, 康治 申請人:奧林巴斯株式會社, 獨立行政法人產業技術綜合研究所