專利名稱：一種防治甲流的中藥組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種防治甲流的中藥組合物及其應用。
背景技術：
流行性感冒，簡稱流感，是由流行性感冒病毒引起的一種人獸共患的急性呼吸道傳染病。主要通過空氣飛沫經呼吸道傳播，具有高度的傳染性，發病時出現急起高熱、惡寒、 全身酸痛、乏力和呼吸道癥狀。其以病程短、傳染性強、發病率高為特點，是對人類健康威脅最大和人類至今尚不能有效控制的世界性傳染病之一。對流感病毒的預防和治療主要有疫苗和化學合成藥。由于流感病毒的抗原變異能力極強且相當頻繁，使得疫苗效果不穩定，對易感人群的保護率不高；況且疫苗只對已知的流感病毒亞型有預防作用，對由于抗原性漂移或轉換所產生的新型流感病毒無效。現有抗病毒藥離子通道阻斷劑和神經氨酸酶抑制劑正式應用于臨床，但耐藥性及嚴重毒副作用的產生限制了其在臨床上的廣泛應用；流感病毒吸附抑制劑、細胞-病毒膜融合抑制劑和反義核苷酸等還處于實驗室研究階段，至今尚缺乏理想的抗病毒藥物。因此開發安全有效的抗流感病毒新藥是當前醫學界面臨的重要課題。

發明內容
本發明目的即是為了提供一種療效肯定、性效穩定，質優價廉、應用廣泛的防治甲流的中藥組合物及其應用。本發明采用的技術方案是一種防治甲流的中藥組合物，由質量配比如下的組分組成荊芥1 5份；防風 1 5份；板藍根1 5份；大青葉1 5份；前胡1 5份；杏仁1 5份；白芷1 5份； 陳皮1 5份；生甘草1 5份。優選的，所述組合物質量配比如下荊芥5份；防風5份；板藍根5份；大青葉5份； 前胡5份；杏仁5份；白芷5份；陳皮5份；生甘草5份。方中荊芥和防風辛散氣香，均長于發表散風，且微溫不烈，藥性和緩，表寒表熱皆可用之，《本草綱目》載荊芥“其功長于祛風邪，散瘀血，破結氣，消瘡毒”；《本草匯言》“用防風辛溫輕散，潤澤不燥，能發邪從毛竅出”。兩者相須為用，其效益彰，《本草求真》指出“用
以防風之必兼用荊芥者，以其能入肌膚宣散故耳-------糜不藉其輕揚，以為宣泄之具”。更
有白芷芳香濃烈，味辛力厚，善通肌膚、透毛竅，祛風散寒，為解表通腠之良藥，《本草匯言》 “白芷，上行頭目，下抵腸胃，中達肢體，遍通肌膚以至毛竅，而利泄邪氣”。上述三藥相伍為用，解表散邪之力尤著。板藍根、大青葉苦寒，既清肺胃心經實火，又善解瘟疫時毒，并能涼血消斑，《本草便讀》“板藍根功用性味與靛青葉同，能入肝胃血分，不過清熱、解毒、辟疫、殺蟲四者而已。 但葉主散，根主降，此又同中之異耳”。生甘草得中和之性，能調和藥性，又可緩和脾胃，也有清熱解毒之功，《藥品化義》“甘草，生用涼而瀉火，主散表邪，消癰腫，利咽痛，解百藥毒，除胃積熱”。五藥合用，使疫毒得清、里熱得解，以截斷疾病傳變之路，防止外邪化熱造成種種變證。前胡苦辛微寒，能開宣肺氣、降氣化痰，《本草綱目》“前胡乃手足太陰、陽明之藥，
其功長于下氣-------氣下則火降，痰亦降矣”。杏仁主入肺經，味苦能降，且兼疏利開通之
性，降肺氣之中兼有宣肺之功而達止咳平喘之能，《長沙藥解》“杏仁疏利開通，破壅降逆， 善于開痹而止喘，消腫而潤燥，調理氣分之郁，無以易此”。陳皮辛行苦泄而能宣肺止咳，《本草求真》“陳皮有散痰、開痰理氣之功”。上述九味藥物聯合應用，清熱解毒，宣肺解表，則邪去正安，諸癥盡除。從抗病毒藥物的傳統功效分布來看，具有直接抗病毒感染活性的單味中草藥以清熱解毒類藥物居多，現代藥理和臨床實踐證明，大青葉、板藍根、魚腥草、金銀花、連翹、野菊花、黃芩、黃連、柴胡、黃柏、甘草等幾十種單味中藥具有顯著的抗流感病毒作用，并從這些中藥當中已經提取分離得到抗流感病毒的活性成分。板藍根長期以來一直用于預防和治療流感、流腦、肝炎、腮腺炎、丹毒等病證，尤其是在預防和治療流感方面效果顯著。試管和雞胚實驗證明，50%板藍根注射液對流感病毒 PR8株及京科68-1株有明顯的抑制作用，100%板藍根煎劑有延緩京科68-1株和腺病毒-T 型所致細胞病變作用。以雞胚法考察15個種質的板藍根對甲型流感病毒的抑制作用，血凝滴度實驗顯示，板藍根的水提醇沉液對病毒的直接作用、治療作用、預防作用有效率分別為 100%、60%、70%。在對板藍根抗病毒有效部位的篩選實驗中，表明板藍根抗流感病毒有效部位為陽離子樹脂吸附部分，并進一步證實有效部位為結合氨基酸。板藍根生物堿成分中的4 (邪)-喹唑酮經藥理實驗證明具有抑制流感病毒、柯薩奇病毒的活性。在對板藍凝集素粗提液抗流感病毒的研究中發現，板藍根凝集素對流感病毒具有顯著的直接殺滅作用和預防作用及良好的治療作用，而且抑制流感病毒的效果與板藍根凝集素血凝活性的高低有關。大青葉和板藍根一樣都是優良的廣譜抗病毒中草藥，對多種病毒有直接抑制作用，試驗證實大青葉在抗甲型流感病毒方面療效顯著，與大青葉抗病毒作用相關的化學成分主要是4(3H)喹唑酮。目前對其抗病毒作用機制尚無定論，一般認為大青葉是通過多種有效成分，多環節、多途徑地發揮協同作用而表現出抗病毒功效。早在1979年Pompei等就發現甘草酸有抗病毒活性，能抑制很多不相關的DNA、RNA 病毒的生長，并且不影響正常細胞的活性。對甘草酸影響感染A2型流感病毒小鼠存活率的研究表明實驗組小鼠存活都超過了 21天，而對照組小鼠沒有存活超過21天的(平均存活時間10. 5天)，在肺組織實變程度及被感染小鼠肺組織病毒值方面，實驗組也明顯低于對照組。現代藥理試驗證實，荊芥、防風、白芷和陳皮等藥物亦有一定的抗病毒活性和抗病原微生物作用，能夠保護細胞不受病毒侵襲。本發明還涉及所述中藥組合物在制備防治甲流的藥物中的應用。所述藥物可制成下列之一的劑型(1)顆粒劑、(2)片劑、(3) 口服液、(4)膠囊劑， 可由所述中藥組合物經提取后添加合適的輔料制成。優選的，所述藥物為顆粒劑，制備所述顆粒劑的中藥原料質量組成為荊芥1 5 份；防風1 5份；板藍根1 5份；大青葉1 5份；前胡1 5份；杏仁1 5份；白芷1 5份；陳皮1 5份；生甘草1 5份；所述顆粒劑由如下方法制得將配方量的中藥原料加水浸沒浸漬0. 5 1小時，煎煮2次，每次1 2小時，合并兩次煎液，過濾，濾液濃縮至相對密度為1. 08 1. 12，冷卻后加乙醇至乙醇體積含量為60%，充分攪拌，冷藏靜置12 小時以上，取醇沉上清液，過濾，濾液減壓回收乙醇，繼續濃縮至相對密度為1. ；34 1. 40清膏，取清膏加入質量為清膏質量1. 5 2. 0倍的淀粉，攪勻、制粒、干燥、整粒，混勻，即得所述顆粒劑。本發明依據祖國中醫傳統理論對時疫流行感冒的致病機理和治療原則的論述和理解，結合現代醫學成果，精選具有清熱解毒，宣肺解表功效的純中草藥，經科學炮制，制成藥物制劑，用于抑制和消除流感病毒。本發明所述的中藥組合物的有益效果主要體現在本發明組合物處方精簡、配伍合理，不僅療效肯定，彌補了中、西藥治療甲流的不足，而且穩定性高、使用方便，制成顆粒沖劑體積小，重量輕，解決了臨床中湯劑的制備麻煩、攜帶不便、不易保存、服用困難等問題，并且藥物含量成分明確，避免了中藥湯劑組分不明的缺點，保障了用藥安全，實為一種有效、應用前景良好的新型藥物。


圖1為含藥血清體外抑制甲型流感病毒作用研究；其中a為正常MDCK細胞，b為病毒對照孔CPE，c為空白血清對照孔CPE，d為防感顆粒低劑量孔CPE，e為防感顆粒中劑量孔CPE，f為防感顆粒高劑量孔CPE，g為達菲血清對照孔CPE。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 處方
荊芥
防風83
板藍根
大青葉幻3g
前胡83
杏仁
白芷83
陳皮83
生甘草
工藝將以上諸藥加水過藥面浸漬0. 5小時，煎煮二次，第一次1. 5小時，第二次1小時， 合并兩次煎液，過濾，濾液經單效外循環濃縮器濃縮至相對密度為1.08(60°C )，冷卻后加乙醇至含醇量(ν/ν)達60%，充分攪拌，冷藏靜置12小時；次日取醇沉上清液，過濾，濾液減壓回收乙醇，繼續濃縮至相對密度約為1. 38 (600C )的清膏；按質量為清膏質量1. 8倍加入淀粉攪勻、制粒、干燥(80°C以下)、整粒，混勻制成600g (即每g含處方藥材1. 66g)，包裝即得顆粒劑，即防感顆粒。實施例2 含藥血清體外抑制甲型流感病毒作用研究一、材料與方法(一 )實驗材料1.各組大鼠血清取清潔級SD大鼠36只，雌雄各半，體重200士20g，按體重分層隨機分為正常(空白)對照組、防感顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組、達菲對照組，每組6只，雌雄分籠喂養。按體型系數換算法( 進行實驗動物與人用藥量的換算，防感顆粒(按實施例1方法制得)低劑量組給藥劑量為10. 21g/kg，相當于臨床等效劑量；中劑量組給藥量為低劑量組的2倍，即20. 42g/kg ；高劑量組為低劑量組的5倍，即51. 05g/kg ；達菲對照組給藥劑量0. 02g/kg,分別灌胃給藥，正常對照組以生理鹽水灌胃，每天2次，每次 lml/100g,連續給藥共3天，末次給藥后Ih腹主動脈無菌采血。大鼠以3 %戊巴比妥腹腔麻醉后，用75%酒精腹部浸泡消毒5分鐘，沿腹正中線皮膚剪開腹腔，使腹主動脈暴露，用無菌注射器吸取血液，血樣置于無菌離心管中，靜置2h以上，待血塊收縮良好后，3000r/min 15min在超凈工作臺上無菌分離血清，經56°C、30min滅活處理，_20°C冰箱凍存備用。2.單層MDCK細胞制備MDCK細胞由浙江省疾病預防與控制中心病毒所提供。 RPMI1640生長液含10%胎牛血清、100Iu/ml雙抗；RPMI1640維持液不含胎牛血清、其它同生長液。3.病毒甲1型流感病毒株A/PR/8/34 (HlNl)，由浙江省疾病預防與控制中心病毒所提供，在9日齡雞胚中增殖復壯，收集尿囊液，-70°C超低溫冰箱凍存備用。4.主要試劑
RPMI1640批號 8108008美國GIBCO公司；
胎牛血清批號080412杭州四季青生物工程材料有限公司；
雙抗批號274564美國GIBCO公司；
0. 25%胰酶-0. 02% EDTA 批號 08061201杭州吉諾生物醫藥技術有限公司
PBS (PH7. 2 士 0.1)批號 08070302GIB00杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；
MTT批號13對劭7Amersco上海生工生物工程有限公司；
DMSO批號0記41；345Amersco杭州熒光泰生物技術有限公司
乳酸脫氫酶(LDH-L)試劑盒批號11342德國prodia diagnostics公司；
1.2%豚鼠紅細胞懸液自備°
5.主要設備
倒置相差顯微鏡(Leica DC-300) Made in Germany ；
超低溫冰箱(Forma 8525) Made in USA ；
生物安全柜(FormaClassII)CO2 恒溫培養箱(Forma ClasslOO)25cm2 細胞培養瓶(Corning Flask)96孔細胞培養板(Becton)酶標儀(BioiTekELX808)微孔板震蕩儀(MH-I)
Made in USA ； Made in USA ； Made in USA ； Made in USA ； Made in USA ；
海門市其林貝爾儀器制造有限公司；AER0SET 全自動生化分析儀系統(Abbott) Made in USA ；( 二 )實驗方法1.甲型流感病毒半數組織細胞感染量(TCID50)測定以不含胎牛血清的RPMI1640維持液將病毒10倍遞增稀釋為10—1、10_2、10_3、10_4、 IO-5UO-6UO-7UO-8 8個不同稀釋度，分別加至長滿單層MDCK細胞的96孔細胞培養板上， 每個濃度病毒稀釋液接種6孔，每孔lOOul，同時設正常細胞對照孔，37°C、5% CO2恒溫培養箱中孵育2h，棄病毒液，用PBS洗板2次，然后各孔再加入IOOul維持液，每日倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，連續3天，采用Reed-Muench法計算病毒的半數組織細胞感染量 (TCID50)。2.含藥血清對甲型流感病毒增殖抑制作用(治療給藥方式，先感染病毒再給含藥血清)預先用96孔細胞培養板將MDCK細胞培養成單層，每孔接種100TCID50甲1型流感病毒液100ul，于37°C、5% CO2培養箱中吸附池感染細胞，棄病毒液，用PBS洗板2次。 取已制備好的終濃度均為1 8的正常(空白)對照組、各劑量組防感顆粒、達菲對照組血清分別加入已經感染的細胞板中，每孔lOOul，每份血清平行測定2孔，同時設正常細胞和病毒對照孔，37°C,5% CO2恒溫培養箱中孵育2h，棄血清，用PBS洗板2次，然后各孔再加入 IOOul維持液，每日到置顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)進展情況。當病毒對照孔出現 +++以上病變時(圖1)，每孔加入MTT (終濃度0. 5mg/ml)20ul,37°C>5% CO2孵育4h，棄去上清液，每孔加入DMS0150ul并以微孔板震蕩機振蕩作用lOmin，待顆粒完全溶解后，酶標儀490nm測吸光度值(0D值)，空白孔調零，計算病毒抑制率。病毒抑制率<% =(各實驗組平均OD值-病毒對照孔平均OD值)/ (正常細胞對照孔平均OD值-病毒對照孔平均OD值)χ100%3.含藥血清對甲型流感病毒吸附細胞的影響(預防給藥方式，先給含藥血清后感染病毒)將已制備好的正常(空白)對照組、各劑量組防感顆粒、達菲對照組血清(終濃度均為1 8)加入已經長成單層細胞的培養板中，每份血清2孔，每孔lOOul，同時設正常細胞和病毒對照孔，恒溫培養箱中孵育池，棄去血清，再接入100TCID50甲1型流感病毒液每孔lOOul，同2.法培養與檢查。4.含藥血清對甲型流感病毒的直接殺滅作用(含藥血清與病毒同時作用)將正常(空白)對照組、各劑量組防感顆粒、達菲對照組血清(終濃度均為1 8) 分別與100TCID50甲1型流感病毒液等量混合，恒溫培養箱中作用池，將混合液加至已長滿單層MDCK細胞的培養板上，同2.法培養與檢查。5.含藥血清對甲型流感病毒感染MDCK細胞膜通透性的影響
另外取96孔細胞培養板將MDCK細胞培養成單層后，同上法將各組血清以上述3 種不同給藥方式分別作用于細胞，當病毒對照孔出現+++以上病變時，從實驗各孔取50ul 上清液到1. 5ml Eppendorf管中，在Eppendorf管中先加入含緩沖基質液的檢測試劑1. Oml 37°C混合反應5min、再加入含輔酶I溶液的試劑0. 5ml混合延遲lmin，AER0SET全自動生化分析儀系統檢測乳酸脫氫酶活性，于340nm處分別讀取吸光度A值至2min，計算LDH值。 LDH (U/L) = ( Δ A/min 樣品 _ Δ A/min 空白)/ ( Δ A/min 標準-Δ A/min 空白)X 標準液濃度。6.含藥血清對甲型流感病毒血凝效價的影響從2. 5.實驗各孔另取25ul上清液到96孔u型微量反應板中，在反應板中加入已配制好的1. 2%豚鼠紅細胞懸液25ul，輕輕混勻后室溫放置45min，觀測血凝活性。各孔出現紅細胞凝集程度以++++、+++、++、+、-表示，紅細胞呈細砂粒狀均勻鋪于孔底者為++++， 即100%凝集；紅細胞均勻鋪于孔底，但邊緣不整而稍向孔底集中者為+++，即75%凝集；紅細胞于孔底形成一個環狀，四周有小凝集塊者為++，即50%凝集；紅細胞于孔底形成圓團， 但邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊者為+，即25%凝集；紅細胞于孔底形成圓團，邊緣光滑整齊，將板傾斜片刻，就可見紅細胞滑動象人的眼淚滴樣者為_，即無凝集。血凝效價以++ 為終點，即以能夠使50%紅細胞凝集的病毒液的最高稀釋度的倒數作為該病毒血凝素的血凝效價。7.統計學處理以SpSS13. 0軟件進行統計分析，描述指標采用均數士標準差表示，血凝效價經數據轉換為對數值后計算均數士標準差，多組樣本均數間
的比較采用單因素方差分析F檢驗法，兩兩比較用q檢驗。二、結果(一 )甲型流感病毒半數組織細胞感染量(TCID50)測定病毒攻擊MDCK細胞后Mh，10—1濃度孔即有2孔發生+的CPE，其余各孔未見CPE。 病變持續進展，到第3天時，ΙΟ"1濃度孔6孔均發生+++ ++++的CPE，10_2有5孔、10_33 孔、10_42孔、10_51孔、10_61孔發生細胞病變，10人ΙΟ"8及正常細胞對照孔沒有細胞病變。根據細胞的病變情況，采用Reed-Muench法計算得出TCID50為10_3_47l00ul，含藥血清藥效實驗中選用病毒攻擊量為100TCID5(1/100ul。見表1。表1 甲型流感病毒對MDCK細胞CPE的影響
權利要求
1.一種防治甲流的中藥組合物，由質量配比如下的組分組成荊芥1 5份；防風1 5份；前胡1 5份；板藍根1 5份；大青葉1 5份；杏仁1 5份；白芷1 5份；陳皮1 5份；生甘草1 5份。
2.如權利要求1所述的中藥組合物，其特征在于所述組合物質量配比如下荊芥1份； 防風1份；前胡1份；板藍根1份；大青葉1份；杏仁1份；白芷1份；陳皮1份；生甘草1 份。
3.如權利要求1所述中藥組合物在制備防治甲流的藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述藥物制成下列之一的劑型(1)顆粒劑、 ⑵片劑、(3) 口服液、(4)膠囊劑。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述藥物為顆粒劑，制備所述顆粒劑的中藥原料質量組成為荊芥1 5份；防風1 5份；前胡1 5份；板藍根1 5份；大青葉 1 5份；杏仁1 5份；白芷1 5份；陳皮1 5份；生甘草1 5份；所述顆粒劑由如下方法制得將配方量的中藥原料加水浸沒浸漬0. 5 1小時，煎煮2次，每次1 2小時， 合并兩次煎液，過濾，濾液濃縮至相對密度為1. 08 1. 12，冷卻后加乙醇至乙醇體積含量為60%，充分攪拌，冷藏靜置12小時以上，取醇沉上清液，過濾，濾液減壓回收乙醇，繼續濃縮至相對密度為1. 34 1. 40清膏，取清膏加入質量為清膏質量1. 5 2. 0倍的淀粉，攪勻、 制粒、干燥、整粒，混勻，即得所述顆粒劑。
全文摘要
本發明涉及一種防治甲流的中藥組合物，由質量配比如下的組分組成荊芥1～5份；防風1～5份；前胡1～5份；板藍根1～5份；大青葉1～5份；杏仁1～5份；白芷1～5份；陳皮1～5份；生甘草1～5份。本發明所述的中藥組合物的有益效果主要體現在本發明組合物處方精簡、配伍合理，不僅療效肯定，彌補了中、西藥治療甲流的不足，而且穩定性高、使用方便，制成顆粒沖劑體積小，重量輕，解決了臨床中湯劑的制備麻煩、攜帶不便、不易保存、服用困難等問題，并且藥物含量成分明確，避免了中藥湯劑組分不明的缺點，保障了用藥安全，實為一種有效的、應用前景良好的新型藥物。
文檔編號A61P31/16GK102198192SQ201110139259
公開日2011年9月28日 申請日期2011年5月26日 優先權日2011年5月26日
發明者宋康, 曹羽, 汪玉冠, 陳芳, 駱仙芳 申請人:浙江省中醫院