專利名稱：一種復(fù)合高分子納米顆粒及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種復(fù)合高分子材料的納米顆粒，作為口服藥物的緩釋載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物的包裹、運(yùn)輸和緩釋的運(yùn)用。
背景技術(shù)：
大部分藥物是通過口服和注射進(jìn)入人體的，與注射途徑相比較，口服途徑更加安全，省時(shí)有效。但因胃部酸性環(huán)境、胃腸道蛋白水解酶的降解作用和胃腸黏膜的多重作用因素，一些藥物特別是酸敏性藥物和蛋白類藥物在達(dá)到腸道之前已經(jīng)被胃酸和胃蛋白酶基本破壞，導(dǎo)致藥物最終的吸收能力極差，生物利用度低。此外，蛋白類藥物的半衰期也很短，通常只有幾分鐘。所以，將上述藥物包裹在其他的組分中可以避免藥物吸收能力差，利用度低的問題。所以尋找并制備出可用于負(fù)載口服藥物的載體或緩釋載體顯得尤為重要。目前，已經(jīng)用于負(fù)載口服藥物的載體主要有:⑴微球⑵微囊⑶無機(jī)納米顆粒高分子納米顆粒(5)脂質(zhì)體(6)乳劑和和(7)凝膠劑。多年的研究表明，上述的口服藥物的載體各有利弊，在運(yùn)用中也暴露出很多問題，如:微球的粒徑過大，難以快速釋放內(nèi)部包裹的藥物；微囊和脂質(zhì)體容易在消化系統(tǒng)的運(yùn)輸過程中破裂，導(dǎo)致藥物的損失，其制備工藝較復(fù)雜；大部分無機(jī)納米顆粒自身不能降解，卻能透過腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致肝臟、腎臟等臟器的無機(jī)納米顆粒積累，具有潛在的安全隱患；乳劑和凝膠劑也存在運(yùn)輸過程中破裂，導(dǎo)致藥物的損失的缺陷，同時(shí)部分組成(如聚氧乙烯蓖麻油)使用過量后可導(dǎo)致人體內(nèi)組織胺大量釋放，引起過敏反應(yīng)。目前，高分子制備的口服用的納米顆粒的研究較少，主要存在的原因在于:(I)成分單一，由于高分子納米顆粒的成分為一種或兩種材料，其載體的藥物釋放的控制難以有效掌握，如聚乳酸(PLA)納米顆粒。(2)腸道細(xì)胞吞噬率低，大部分高分子納米顆粒的腸道細(xì)胞吞噬率均較低。(3)表面活性劑殘留，如果高分子納米顆粒制備過程中使用表面活性劑，必然導(dǎo)致表面活性劑的殘留，如油酸鈉等。所以急需一種能克服上述問題的復(fù)合型高分子材料的納米顆粒，作為口服藥物的緩釋載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物的包裹、運(yùn)輸和緩釋的運(yùn)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及的是一種復(fù)合高分子納米顆粒，用于口服藥物的潛在載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物載體的運(yùn)用。本發(fā)明提供一種復(fù)合高分子納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為50-2000nm，包含聚羥基丁酸(PHB)、乳酸- 乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羥基丁酸己酸(PHBHHx)三種組分，其中聚羥基丁酸為10% _25%，乳酸-乙醇酸共聚物為占10% -25%，聚羥基丁酸己酸為50% -80%。所述的復(fù)合高分子納米顆粒的藥物包封率大于70%。
所述的復(fù)合高分子納米顆粒可以被Caco2腸道上皮細(xì)胞所吞噬。所述的復(fù)合高分子納米顆粒生物相容性好，其細(xì)胞存活率大于80%。本發(fā)明提供一種復(fù)合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(I)聚乙烯醇溶解于水，作為水相；(2)乳酸-乙醇酸共聚物\聚羥基丁酸\聚羥基丁酸己酸溶解于氯仿中，作為油相；(3)水相和油相混合并進(jìn)行乳化處理形成初乳；(4)初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑；(5)經(jīng)過離心或過濾處理得到除去聚乙烯醇的用于口服藥物載體的復(fù)合高分子納米顆粒懸浮液。所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷中的一種及其組合。

所述水相中聚乙烯醇的含量為10g_30g/1000ml。所述乳化處理為勻漿機(jī)處理，或超聲機(jī)處理。所述水相和油相的體積比為10: I 30: I。所述納米顆粒進(jìn)行初步的粒徑分離通過靜置、調(diào)節(jié)離心速度和離心時(shí)間及過濾來實(shí)現(xiàn)；其中靜置時(shí)間為0.5-48小時(shí)，離心速度為6000-120000轉(zhuǎn)每秒，離心時(shí)間為10-25分鐘。本發(fā)明提供一種復(fù)合高分子納米顆粒作為口服藥物載體的應(yīng)用。以紅色染料羅丹明異硫氰為藥物模型，添加入反應(yīng)體系中。并用于人直腸細(xì)胞Caco2的吞噬實(shí)驗(yàn)。三種材料混合后，被上皮細(xì)胞吞噬的能力最佳，這為上述的復(fù)合材料納米顆粒作為口服藥物載體最重要的提供依據(jù)。該納米顆粒沒有其他雜質(zhì)和有機(jī)溶劑的殘留。工藝制備十分簡單，成分較低，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明中IOOOnm級納米顆粒的掃描電子顯微鏡圖片。圖2為本發(fā)明中400nm級納米顆粒的掃描電子顯微鏡圖片。圖3為本發(fā)明中納米顆粒被Caco2細(xì)胞圖示的激光共聚焦顯微鏡圖片。I為被細(xì)胞吞噬后的負(fù)載了羅丹明異硫氰的納米顆粒，2為被染料標(biāo)記的細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式PLGA\PHB\PHBHHx 材料的純化。將PLGA、PHB和PHBHHx是三種材料分別按照1:1: 8，1:1: 5和1:1: 2的質(zhì)量比混合后，稱取2g混合材料溶解于80ml的三氯甲烷中，40-60°C加熱至完全溶解，用布氏漏斗抽濾除去不溶于三氯甲烷的雜質(zhì)。將上述有機(jī)溶劑緩慢導(dǎo)入2000ml的無水乙醇中。輕度攪拌，靜置24-72小時(shí)。用布氏漏斗除去大部分無水乙醇，冷凍干燥機(jī)處理最終除去殘余的無水乙醇。即可得到純化后的PLGA\PHB\PHBHHx材料。實(shí)施例1:
粒徑為IOOOnm級納米顆粒的制備。具體步驟如下:(I)將Ig的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相(W)；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作為油相(O)；(3)將水相和油相按10:1的比例混合，并勻漿機(jī)6000轉(zhuǎn)每分鐘攪拌2分鐘形成初乳(W1/0):(4)將初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑；(5) 7000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復(fù)步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時(shí)，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8)繼續(xù)靜置48小時(shí)，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中，保留沉淀即為粒徑為IOOOnm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數(shù)據(jù)見表1，掃描電子顯微鏡圖見圖1。實(shí)施例2:粒徑為400-10000nm級納米顆`粒的制備。具體步驟如下:(I)將1.5g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油相按照15: I的比例混合，并勻漿機(jī)24000轉(zhuǎn)每分鐘攪拌2分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑；(5) 10000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復(fù)步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時(shí)，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 10000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，大于IOOOnm的納米顆粒將沉淀，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數(shù)據(jù)見表I。實(shí)施例3:粒徑小于400nm級納米顆粒的制備。具體步驟如下:(I)將2g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油相按照20:1的比例混合，并超聲機(jī)240瓦的功率處理10分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑；(5) 11000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復(fù)步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時(shí)，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 11000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理15分鐘,大于800nm的納米顆粒將沉淀,小于800nm
的納米顆粒將懸浮于上清中。(9)利用PALLs 450nm的過濾頭(PALL，美國)過濾上述上清液，最終得到的過濾液即為小于400nm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數(shù)據(jù)見表1，掃描電子顯微鏡圖見圖2。實(shí)施例4:粒徑為IOOOnm級負(fù)載了突光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒的制備。具體步驟與實(shí)施例2的步驟類似，具體如下:(I)將Ig的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的羅丹明異硫氰溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油 相按照20:1的比例混合，并勻漿機(jī)6000轉(zhuǎn)每分鐘攪拌2分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑；(5)7000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復(fù)步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時(shí)，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8)繼續(xù)靜置48小時(shí)，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中，保留沉淀即為粒徑為IOOOnm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數(shù)據(jù)見表I。將步驟5)中所述的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液進(jìn)行分光光度計(jì)檢測，確定沒有包封的羅丹明異硫氰含量，并計(jì)算成樣品的包封率。包封率的計(jì)算公式見下:包封率(％ )=(總羅丹明異硫氰含量-沒有包封的羅丹明異硫氰含量)/總羅丹明異硫氰含量包封率結(jié)果見表2。實(shí)施例5:粒徑為400-1000nm級負(fù)載了突光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒的制備。具體步驟與實(shí)施例2的步驟類似，具體如下:(I)將1.5g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的羅丹明異硫氰溶解于20ml的氯仿中作為油相；
(3)將水相和油相按照20: I的比例混合，并勻漿機(jī)24000轉(zhuǎn)每分鐘攪拌2分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑；(5) 10000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復(fù)步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時(shí)，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 10000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，大于IOOOnm的納米顆粒將沉淀，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數(shù)據(jù)見表I。將步驟5)中所述的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液進(jìn)行分光光度計(jì)檢測，確定沒有包封的羅丹明異硫氰含量，并計(jì)算成樣品的包封率。包封率的計(jì)算公式見下:包封率(％ )=(總羅丹明異硫氰含量-沒有包封的羅丹明異硫氰含量)/總羅丹明異硫氰含量包封率結(jié)果見表2。實(shí)施例6: 粒徑為400-1000nm級負(fù)載了突光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒的制備。(I)將2g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的羅丹明異硫氰溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油相按照20: I的比例混合，并超聲機(jī)240W的功率處理10分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑；(5) 11000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復(fù)步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時(shí)，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 11000轉(zhuǎn)每分鐘離心處理15分鐘,大于800nm的納米顆粒將沉淀,小于800nm
的納米顆粒將懸浮于上清中。(9)利用MLLs 450nm的過濾頭(PALL，美國)過濾上述上清液，最終得到的過濾液即為小于400nm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數(shù)據(jù)見表I。將步驟5)中所述的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液進(jìn)行分光光度計(jì)檢測，確定沒有包封的羅丹明異硫氰含量，并計(jì)算成樣品的包封率。包封率的計(jì)算公式見下:包封率)=(總羅丹明異硫氰含量-沒有包封的羅丹明異硫氰含量)
/總羅丹明異硫氰含量包封率結(jié)果見表2。納米顆粒的Caco2細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn):分解將實(shí)施例4-6中所制備的負(fù)載了熒光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒精確稱量后分散在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，配置成不同濃度的顆粒懸浮液。用人直腸上皮細(xì)胞Caco2作為試驗(yàn)用的細(xì)胞株。分別接種10萬個(gè)細(xì)胞于48孔板中，待細(xì)胞生長完全覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)板后，依次加入不同的上述顆粒懸浮液Iml。分別培養(yǎng)I小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)和24小時(shí)后，移去原先的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibc o，美國)，再用磷酸緩沖溶液洗3次取出沒有吞噬的納米顆粒，再加入含有綠色熒光染料FDA的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基染色5分鐘。用激光共聚焦顯微鏡觀察沒400個(gè)細(xì)胞中，含有紅色顆粒的細(xì)胞的數(shù)量并計(jì)算出所占總細(xì)胞的比率為納米顆粒吞噬率(個(gè)/400個(gè)細(xì)胞)，數(shù)據(jù)見表3和圖3。通過納米顆粒吞曬率可以發(fā)現(xiàn),顆粒粒徑越小的納米顆粒,越容易被Caco2細(xì)胞所吞噬。納米顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):分解將實(shí)施例1-3中所制備的沒有負(fù)載了熒光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒精確稱量后分散在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，配置成不同濃度的顆粒懸浮液。分別用人直腸上皮細(xì)胞Caco2和小鼠成纖維細(xì)胞L929作為試驗(yàn)用的細(xì)胞株。分別接種I萬個(gè)細(xì)胞于96孔板中，待細(xì)胞生長24小時(shí)后，依次加入不同的上述顆粒懸浮液100 μ I。分別培養(yǎng)24后，利用細(xì)胞活性試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性檢測，450nm的波長下收集吸光值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下:細(xì)胞存活率)=樣品的吸光值/對照的吸光值*100%數(shù)據(jù)見表4和表5。通過納米顆粒吞噬率可以發(fā)現(xiàn)，用PLGA\PHB\PHBHHx制備的納米顆粒的生物相容性均較好。表1.所制備的不同級別的納米顆粒的粒徑大小
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合高分子納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為50-2000nm,包含聚羥基丁酸(PHB)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羥基丁酸己酸(PHBHHx)三種組分，其中聚羥基丁酸為10% _25%，乳酸-乙醇酸共聚物為占10% -25%，聚羥基丁酸己酸為50% -80%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種復(fù)合高分子納米顆粒，其特征在于，所述的復(fù)合高分子納米顆粒的藥物包封率大于70%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，或2所述一種復(fù)合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)聚乙烯醇溶解于水，作為水相； (2)乳酸-乙醇酸共聚物\聚羥基丁酸\聚羥基丁酸己酸溶解于氯仿中，作為油相； (3)水相和油相混合并進(jìn)行乳化處理形成初乳； (4)初乳倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，除去有機(jī)溶劑； (5)經(jīng)過離心或過濾處理得到除去聚乙烯醇的用于口服藥物載體的復(fù)合高分子納米顆粒懸浮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種復(fù)合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷中的一種及其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種復(fù)合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述水相中聚乙烯醇的含量為10g-30g/1000ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種復(fù)合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述乳化處理為勻漿機(jī)處理，或超聲機(jī)處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種復(fù)合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述水相和油相的體積比為10: I 30:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種復(fù)合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述納米顆粒進(jìn)行初步的粒徑分離通過靜置、調(diào)節(jié)離心速度和離心時(shí)間及過濾來實(shí)現(xiàn)；其中靜置時(shí)間為0.5-48小時(shí)，離心速度為6000-120000轉(zhuǎn)每秒，離心時(shí)間為10-25分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1，或2所述一種復(fù)合高分子納米顆粒作為口服藥物載體的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合高分子納米顆粒，作為口服藥物載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物載體的運(yùn)用。該復(fù)合高分子納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為50-2000nm，包含聚羥基丁酸(PHB)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羥基丁酸己酸(PHBHHx)三種組分，其中聚羥基丁酸為10％-25％，乳酸-乙醇酸共聚物為占10％-25％，聚羥基丁酸己酸為50％-80％。本發(fā)明還涉及一種復(fù)合高分子納米顆粒得制備方法。該納米顆粒沒有其他雜質(zhì)和有機(jī)溶劑的殘留。工藝制備十分簡單，成分較低，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K47/34GK103169975SQ20111043663
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者魏岱旭, 閆志強(qiáng), 鐘建, 何丹農(nóng) 申請人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司