專利名稱：青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生長因子受體a中的作用及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生長因子受體A中的作用及其應用。
背景技術：
青蒿又名黃花蒿(Artemisia anaua L),屬菊科,是一年生草本植物。青蒿素是我國藥學工作者于20世紀70年代初從中藥青蒿中提取的倍半萜內酯類抗瘧藥物。鑒于傳統的奎寧類藥物普遍遇到抗藥性問題，青蒿素和它的衍生物目前已取代它們，成為世界上抗瘧疾的主流藥物。青蒿素的大環上有一個內過氧化物橋，在亞鐵離子或亞鐵血紅素的催化下，會放出以碳為中心的自由基。細胞內的蛋白質和核酸被這些自由基烷化后死亡。瘧原蟲寄生在紅血球內，含有大量來自血紅蛋白的亞鐵血紅素，因而青蒿素很易被活化，進而將瘧原蟲殺死。青蒿素和它的衍生物，如二氫青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚及青蒿琥酯等已廣泛應用于瘧疾治療，更多的青蒿素衍生物正在研制中。青蒿素及其衍生物的抗瘧活性已得到世界公認，具有起效快、藥效高、毒副作用低等優點。除廣泛應用于抗瘧治療外，青蒿素類藥物還具有其它多種藥理作用，如抗血吸蟲作用、抗心律失常、平喘、抗內毒素、抗變態反應、抗紅斑狼瘡、免疫抑制等作用。隨著對青蒿素及其衍生物活性研究的不斷深入，人們發現，該類化合物對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用和良好的治療效果，然而，其具體作用靶點及相關信號通路及作用機制還不明確。因此本領域迫切需要了解青蒿素及其衍生物在一直腫瘤中的作用。

發明內容
本發明的目的是提供青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生長因子受體A中的作用。本發明的另一目的是提供青蒿素及其衍生物作為血小板衍生生長因子受體A抑制劑/拮抗劑的應用。本發明的另一目的是提供體外治療腫瘤的方法。在本發明的第一方面，提供了一種青蒿素及其衍生物用于制備抑制選自下組疾病的藥物或藥物增敏劑的用途=I3DGFRa陽性腫瘤、血管性疾病、或纖維性病變。在另一優選例中，所述的I3DGFRa陽性腫瘤細胞為TOGFRa陽性卵巢癌細胞或PDGFRa陽性肝癌細胞。在本發明的第二部分，提供了一種青蒿素及其衍生物的用途，用于制備血小板衍生生長因子受體A (H)GFR a )的抑制劑或拮抗劑。在另一優選例中，所述的血小板衍生生長因子受體A (H)GFR a)來自于人。在另一優選例中，所述的抑制劑或拮抗劑還用于:⑴抑制TOGFR a酪氨酸激酶的活化；和/或
(ii)抑制TOGFRa的蛋白穩定性；和/或(iii)促進TOGFRa泛素依賴的蛋白酶體介導的降解；和/或(vi)抑制TOGFR a陽性腫瘤細胞信號通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。在另一優選例中，所述的青蒿素衍生物選自下組:蒿甲醚、二氫青蒿素、青蒿琥酯、雙氫蒿甲醚、蒿乙醚等。在另一優選例中，所述的青蒿素衍生物為二氫青蒿素。在本發明的第三方面，提供了一種體外非治療性地抑制血小板衍生生長因子受體A(PDGFRa)活性的方法，包括步驟:將青蒿素和/或青蒿素衍生物與細胞接觸，從而抑制或拮抗細胞中血小板衍生生長因子受體AQ3DGFRa )。在另一優選例中，所述的接觸是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下，培養所述細胞。在另一優選例中，所述的細胞包括腫瘤細胞,較佳地包括F1DGFRa陽性腫瘤細胞，更佳地包括I3DGFR a陽性卵巢癌細胞或肝癌細胞，如卵巢癌細胞A2780、卵巢癌細胞0VCAR3、肝癌細胞H印3B。在另一優選例中，所述方法還用于至少以下一種應用:體外非治療性地抑制I3DGFR a酪氨酸激酶的活化；體外非治療性地抑 制I3DGFRa的蛋白穩定性；體外非治療性地促進I3DGFR a泛素依賴的蛋白酶體介導的降解；體外非治療性地抑制信號通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和體外非治療性抑制I3DGFRa陽性腫瘤細胞的生長。在本發明的第四方面，提供了一種制劑組合的用途，所述制劑組合包括:(I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制劑；和(II)含吉西他賓或卡鉬的制劑，所述制劑組合用于制備:(a)抑制血小板衍生生長因子受體A的藥物組合物或藥盒；或(b)預防和/或治療腫瘤的藥物組合物或藥盒。在另一優選例中，所述制劑包括:片劑、膠囊、栓劑、注射劑。在另一優選例中，所述腫瘤為I3DGFRa陽性腫瘤。在本發明的第五方面，提供了一種預防和/或治療TOGFRa相關疾病的方法，其中所述疾病與TOGFRa的過表達或活性過高有關，所述方法包括步驟:給需要的對象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的藥物組合物。在另一優選例中，所述的TOGFRa相關疾病包括腫瘤(H)GFRa陽性腫瘤)，如卵巢癌或肝癌。在另一優選例中，PDGFRa陽性腫瘤為TOGFRa陽性卵巢癌或TOGFRa陽性肝癌。在另一優選例中，所述的施用包括:瘤內、靜脈注射、口服片劑、腹腔注射等。在另一優選例中，所述的對象為哺乳動物。 在本發明的第六方面，提供了一種方法，所述方法用于體內或體外抑制I3DGFR a酪氨酸激酶的活化、抑制I3DGFRa的蛋白穩定性、促進TOGFRa泛素依賴的蛋白酶體介導的降解、抑制信號通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制I3DGFR a陽性腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲，所述方法包括步驟:給需要的對象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。在本發明的第七方面，提供了一種用于卵巢癌病理分級的試劑盒，所述試劑盒包含檢測離體組織I3DGFRa表達量的試劑。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1顯示TOGFRa可以作為青蒿素及其衍生物的直接作用靶標；其中，圖1a為體外激酶實驗，結果顯示，青蒿素及其衍生物青蒿素(ART)、二氫青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制TOGFRa胞內端(aa550_末端)酪氨酸激酶的活性；圖1b為表面等離子共振(SPR)實驗，結果顯示，雙氫青蒿素(DHA)可以與TOGFRa包外端(aa24_524)蛋白相互結合，索拉菲尼(Sorafenib)為陽性對照，已知其可以結合抑制PDGFRa的活性；圖1c為生物素-親和素親和純化實驗，結果顯示，標記生物素的DHA可以與A2780細胞內TOGFRa相互結合，從而被親和純化出來；圖1d為計算機輔助同型模建及反向對接實驗(Computer Assisted Homology modeling and docking),結果顯不，雙氫青蒿素(DHA)可以嵌合到TOGFRa包外端TOGF結合位點，同時也可嵌合到其包內端ATP結合位點，阻斷其激酶激活；圖1e-圖1f顯示雙氫青蒿素能夠有效抑制TOGFR a陽性細胞A2780和0VCAR3中TOGFRa的活性和蛋白表達，而對TOGFRi^的磷酸化和蛋白水平影響不大；圖1g-圖1i顯示雙氫青蒿素可以加速TOGFR a的蛋白降解，這一過程是泛素依賴的蛋白酶體介導的。 圖2顯示了青蒿素及其衍生物具有抑制TOGFRa陽性的卵巢癌細胞的生長和遷移能力；其中，圖2a顯示，給予藥物刺激48h后，青蒿素及其衍生物對人正常卵巢上皮細胞10SE144無明顯的生長抑制能力，對于SK-0V3細胞毒性較小，但對于I3DGFRa陽性的A2780和0VCAR3具有較強抑制能力，其中青蒿素和二氫青蒿素的作用最為顯著；圖2b為細胞遷移實驗，結果顯示，低濃度短時間處理(12h)卵巢癌細胞，青蒿素及其衍生物能夠有效地抑制PDGFRa陽性細胞A2780的遷移能力，而對于TOGFRa陰性的細胞SK-0V3無明顯抑制能力；圖2c顯示了不同濃度的雙氫青蒿素對5種細胞系(10SE144、A2780、0VCAR3、0VCAR5、SK-0V3)的細胞抑制作用；圖2d顯示了不同濃度的雙氫青蒿素對3種細胞系(A2780、0VCAR3、SK-0V3)的細胞遷移的影響；圖2e顯示了不同濃度的雙氫青蒿素對2種細胞系(A2780、0VCAR3)的細胞侵襲的影響。圖3顯示青蒿素及其衍生物具有抑制TOGFRa陽性的肝癌細胞的生長和遷移能力；其中，圖3a顯示，在人正常的肝細胞系(7702和L02)和肝癌細胞系0fep3B、HepG2,772U7404、LM3、97L、97M、Huh-7)中，只有H印3B高表達PDGFRa ;圖3b顯示，低濃度雙氫青蒿素(3μΜ)短時(12h)處理H印3B細胞，能夠顯著抑制其遷移和侵襲能力；圖3c為細胞生長實驗，結果顯示，PDGFRa陽性的Hep3B細胞對于雙氫青蒿素更敏感，而其他細胞對于雙氫青蒿素敏感程度較低。
圖4顯示雙氫青蒿素能抑制小鼠原位卵巢癌模型的生長和轉移；其中，圖4a顯示雙氫青蒿素給予治療小鼠，能有有效地抑制卵巢癌的惡性進展；圖4b顯示，與對照組相比，雙氫青蒿素治療組小鼠的肺癌轉移的情況大大降低，且隨著藥量的增加，治療情況越好；圖4c顯示不同濃度的雙青青蒿素給予治療小鼠，腫瘤腹腔播散的情況(肺臟、肝臟、腸)得到明顯的抑制；圖4d為免疫組化實驗，結果顯示，雙氫青蒿素處理的細胞其形態轉換過程(EMT)得到抑制；圖4e為免疫印跡實驗，結果顯示，雙氫青蒿素能夠有效抑制TOGFRa的表達和磷酸化，下游信號通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制。圖5顯示了青蒿素及其衍生物與一線化療藥的增敏作用；其中，圖1a為H印G2和Hep3B細胞用青蒿素或雙氫青蒿素單獨處理或聯合吉西他賓處理實驗，結果顯示，吉西他賓單獨作用于H印G2和Hep3B細胞，具有一定的凋亡促進作用，青蒿素聯合吉西他賓對HepG2和Hep3B細胞都具有顯著凋亡促進作用作用，兩藥聯合表現出協同作用；圖5b顯示，DHA和CBP聯合用藥24小時后對0VCAR-3細胞凋亡有增效促進作用，用I μ M的DHA聯合500 μ M CBP(1155% )作用后的細胞凋亡率顯著高于單獨用ΙμΜ DHA (266 %)或500 μ MCBP(528% )的細胞凋亡率，而且超過了兩種化合物的凋亡累加效應，是一種增效作用，Α2780細胞對聯合治療顯示了累加效應；圖5c顯示，當與DHA聯用時，CBP顯著抑制了卵巢癌細胞的活力，當細胞暴露于I μ M CBP和ΙμΜ DHA時，Α2780細胞的存活率就降低了 69%，而0VCAR-3細胞存活則減少了 72%，相比之下，10SE144細胞則顯得對治療較不敏感，兩種藥物均以I μ M合用時存活率只降低了約28% ;圖5d為肝癌細胞Hep3B和H印G2裸鼠移植瘤實驗，結果顯示，青蒿素和雙氫青蒿素單藥體內均具有抗腫瘤作用，雙氫青蒿素的抑癌作用強于青蒿素，青蒿素及雙氫青蒿素均能增加吉西他賓的抑癌作用，聯合吉西他賓治療效果優于單藥，尤其是雙氫青蒿素表現出顯著的化療致敏作用；圖5e為在卵巢癌細胞A2780和0VCAR3裸鼠移植瘤實驗中，結果顯示，DHA(劑量為10和25mg/kg)分別導致A2780異體移植腫瘤24%和41%的生長抑制(與給生理鹽水的對照組相比)(P < 0.05)，0VCAR-3模型14%和37%腫瘤生長抑制(P < 0.05);只給單一 CBP的治療組腫瘤生長被抑制了 56%(A2780)和 46% (0VCAR-3)，聯合用藥(25mg/kgDHA)組則在 A2780 和 0VCAR-3 動物腫瘤中均產生70%腫瘤生長抑制(P < 0.05)。圖6顯示I3DGF Ra的表達與卵巢癌病理級別和轉移狀態的關系；其中，圖6a顯示，與低級別卵巢癌相比，高級別卵巢癌病例中，腫瘤細胞及周圍的間質細胞I3DGFR α的表達量顯著增加；圖6b為TOGFRa染色結果，結果顯示，在高級別卵巢癌病例中，TOGFRa的表達顯著增加。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，發現青蒿素及其衍生物的用途，用于制備血小板衍生生長因子受體A(H)GFRa )的抑制劑或拮抗劑，此外，青蒿素及其衍生物還可以抑制PDGFRa酪氨酸激酶的活化、抑制TOGFRa的蛋白穩定性、促進TOGFRa泛素依賴的蛋白酶體介導的降解、抑制信號通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制I3DGFRa陽性腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲、還可以用于TOGFRa陽性腫瘤治療的增敏劑。在此基礎上完成了本發明。術語
卵巢癌卵巢癌是全世界的婦女健康的巨大威脅。在美國，卵巢癌已成為第四位致死性的女性癌癥。雖然被診斷于病發早期的卵巢癌患者的5年存活率可以達到80% -90%，但是被診斷為晚期的卵巢癌患者存活率卻只有不到25%，此外，大多數卵巢癌患者在診斷出是卵巢癌是已至晚期。目前卵巢癌患者的死亡率在過去的數十年沒有發生太大的改變，因此在腫瘤治療和預后中，尋找有效的治療方案，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，和克服腫瘤的耐藥性是研究人員和臨床實踐人員長期以來的目標。肝癌肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的高發區，其發病率已上升到惡性腫瘤的第二位。由于肝癌早期癥狀不明顯，因此確診的大多數病人已處于中、晚期。原發性肝癌的首選治療是手術切除，隨著治療技術的提高，目前術后5年生存率已提高至50%-60%，但由于手術切除只適用直徑不超過5cm、癌灶數目不超過3個的小肝癌。此外，是否適合直接手術切除還取決于癌灶部位的血管富集程度及病人個體差異，這些限制導致90%左右的肝癌不適合手術治療。即使是可切除肝癌，術后實施以介入化療為主的綜合性治療也是必要的。然而目前，鮮有藥物能夠有效抑制肝癌的生長和進一步惡化，肝癌對傳統化療藥物的反應率低，毒副作用非常顯著，因此化療的緩慢發展是制約抗腫瘤藥物臨床應用的主要原因。因此對于腫瘤化療來說，迫切需要尋求更好的化療增效劑和更好的治療方案，從而提高腫瘤對化療的敏感度，降低其對化療的耐藥性。血小板衍生生長因子及其受體血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor, F1DGF)是一類能夠合成并分泌到細胞外基質中的生長因子，具有促進纖維細胞、平滑肌細胞等多重組織的細胞分裂、增殖、遷移、增加細胞的黏附能力，在人胚胎發育和正常生理活動中發揮著重要作用。TOGF以自分泌和旁分泌形式激活血 小板衍生生長因子受體(TOGFR)而發揮作用。PDGFR包含兩種結構類似的酪氨酸激酶受體I3DGFR α和TOGFR β，其中I3DGFR α的異常激活與多重疾病密切相關，具體地，I3DGFR相關疾病可以分為三類:1.腫瘤由于H)GFR(特別是TOGFRa )存在于多種腫瘤中，它可能作為一個新的治療靶點。已經發現，多種腫瘤的發生與H)GFR(特別是TOGFRa )的過度激活相關，如卵巢癌、神經膠質瘤、前列腺癌；此外，在一些腫瘤中存在I3DGFR的突變激活，如隆突性皮膚纖維肉瘤、胃腸道間質瘤、Bcr-Abl陰性的慢性髓樣白血病、嗜酸細胞增多綜合征等等。2.血管性疾病研究發現，PDGF及TOGFR等在多種血管性疾病中存在過量表達和過度激活現象，如動脈粥樣硬化和再狹窄、肺動脈高壓、視網膜血管病變等，抑制TOGFR信號通路的激活可以有效緩解上述疾病的癥狀，增加其治療效果。3.纖維性病變PDGF-PDGFR信號通路在多種纖維性病變過程中發揮重要的作用，如肺纖維化、肝纖維化和肝硬化、皮膚纖維增生(硬皮病)、腎纖維化、心肌纖維化等等，其中TOGF-PDGFR信號通路介導的間質細胞的增殖是該慢性炎癥的共同特征。上述三類疾病中，H)GF-PDGFR信號通路發揮重要的作用，其中TOGFRP主要介導了血管系統病變，而I3DGFRa主要介導了間質細胞和成纖維細胞驅動的病變。(JohannaAndrae, et al.Role of platelet-derived growth factors in physiology andmedicine, Genes Dev.2008 ；22:1276-1312 ;張秀華等，血小板源生長因子受體與腫瘤.生命科學，Vol.18，N0.3 Jun.，2006)青蒿素及其衍生物青篙素是從中藥青篙中提取的有過氧基團的倍半萜內酯藥物，由于青蒿素是復雜的大分子，化學全人工很難合成，因此目前主要是生物合成和人工提取。青蒿素等倍半萜類的生物合成在細胞質中進行，途徑屬于植物類異戊二烯代謝途徑，可分為三大步:由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再內酯化形成青蒿素，具體為:FPP — 4，
11-二烯倍半萜一青蒿酸一二氫青蒿酸一二氧青蒿酸過氧化物一青蒿素。青蒿素和本領域幾種常見的青蒿素衍生物的化學式見下:
權利要求
1.青蒿素及其衍生物用于制備抑制選自下組疾病的藥物或藥物增敏劑的用途PDGFRa陽性腫瘤、血管性疾病、或纖維性病變。
2.一種青蒿素及其衍生物的用途，其特征在于，用于制備血小板衍生生長因子受體A(PDGFRa)的抑制劑或拮抗劑。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑或拮抗劑還用于 (i)抑制TOGFRa酪氨酸激酶的活化；和/或 ( )抑制I3DGFRa的蛋白穩定性；和/或 (iii)促進I3DGFRa泛素依賴的蛋白酶體介導的降解；和/或 (vi)抑制TOGFRa陽性腫瘤細胞信號通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。
4.如權利要求1-2任一所述的用途，其特征在于，所述的青蒿素衍生物選自下組蒿甲醚、二氫青蒿素、青蒿琥酯、雙氫蒿甲醚、蒿乙醚等。
5.一種體外非治療性地抑制血小板衍生生長因子受體A(TOGFRa)活性的方法，其特征在于，包括步驟將青蒿素和/或青蒿素衍生物與細胞接觸，從而抑制或拮抗細胞中血小板衍生生長因子受體A (PDGFR a )。
6.一種制劑組合的用途，所述制劑組合包括 (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制劑；和 (II)含吉西他賓或卡鉬的制劑， 其特征在于，所述制劑組合用于制備 (a)抑制血小板衍生生長因子受體A的藥物組合物或藥盒；或 (b)預防和/或治療腫瘤的藥物組合物或藥盒。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為TOGFRa陽性腫瘤。
8.一種預防和/或治療I3DGFRa相關疾病的方法，其中所述疾病與TOGFR a的過表達或活性過高有關，其特征在于，包括步驟給需要的對象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的藥物組合物。
9.一種方法，所述方法用于體內或體外抑制I3DGFRa酪氨酸激酶的活化、抑制TOGFRa的蛋白穩定性、促進I3DGFRa泛素依賴的蛋白酶體介導的降解、抑制信號通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制TOGFR a陽性腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲，其特征在于，所述方法包括步驟給需要的對象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。
10.一種用于卵巢癌病理分級的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含檢測離體組織PDGFR a表達量的試劑。
全文摘要
本發明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生長因子受體A中的作用及其應用，具體地，青蒿素及其衍生物直接作用于腫瘤的分子靶標血小板衍生生長因子受體A(PDGFRα)，與細胞膜上的PDGFRα結合，抑制PDGFRRα胞內段的酪氨酸激酶的活化，抑制PDGFRα的蛋白穩定性，促進泛素依賴的蛋白酶體介導的降解過程，對于高表達PDGFRα的腫瘤細胞具有劑量依賴的細胞生長抑制和遷移侵襲抑制作用，也可以抑制信號通路PI3K/AKT和MAPK/ERK的活化。
文檔編號A61P17/00GK103251585SQ201210034078
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月15日 優先權日2012年2月15日
發明者王慧, 李曉光, 陳培戰 申請人:中國科學院上海生命科學研究院