專利名稱：一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子－組織蛋白酶b抑制因子的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域中的蛋白質純化技術，具體涉及一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法。
背景技術：
蛋白酶是指水解蛋白質的酶，是維持人體正常生理功能的關鍵分子。根據水解蛋白質的部位不同，可以將蛋白酶分為外肽酶和內肽酶，外肽酶從蛋白質的羧基端或氨基端水解蛋白質，內肽酶從蛋白質的中間水解蛋白質。內肽酶又根據活性中心的氨基酸殘基分為半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，其中，半胱氨酸蛋白酶又包括數十種不同的蛋白酶。在正常生理代謝中，蛋白酶主要參與食物和體內蛋白質的水解，如胃蛋白酶和腸道中的胰蛋白酶水解食物蛋白為人體提供氨基酸；溶酶體蛋白酶參與細胞內非必需的蛋白質水解，使氨基酸得以循環利用；蛋白酶還參與酶原活化，保持體內必需的蛋白水解平衡，如纖溶酶原激活因子tPA使纖溶酶原活化成纖溶酶，水解纖維蛋白，防止或治療血栓引起的心腦血管疾病。但在疾病狀態下，蛋白酶會異常表達，導致蛋白水解異常，最典型的例子是急性胰腺炎時，胰腺破裂，胰液及其中的胰蛋白酶外流，水解正常組織，成為繼心肌梗死和腦血管意外后的第三大高致死性急病。另一個典型例子是腫瘤，目前已經證明腫瘤的發生和惡化是由于某些蛋白酶異常高表達引起的。
大多數腫瘤死亡并不是由于原發腫瘤死亡，而是由于腫瘤轉移到身體的其它部位引起的死亡。惡性腫瘤細胞具有如下特征，可以從原發腫瘤細胞脫落并轉移到鄰近組織、血管和淋巴，可以進入血管作遠距離遷移，然后再出血管，遷移到周圍組織并形成新的腫瘤，形成新的血管以支持腫瘤生長和轉移。正常細胞是由細胞間基質蛋白包括彈性蛋白和膠原蛋白形成的復合網絡固定在組織內的，這些基質蛋白在組織重建、受傷康復和胚胎發育中被水解，癌細胞在從原發部位轉移時也必須水解這些蛋白質，一系列蛋白酶參與了這個過程，包括尿激酶-血纖溶酶原激活因子、半胱氨酸蛋白酶中的組織蛋白酶B和組織蛋白酶L、金屬蛋白酶中的膠原酶等。其中，組織蛋白酶B的高表達被認為是導致某些腫瘤發生和惡化轉移的重要因素，例如乳腺癌，膀胱癌。研究認為組織蛋白酶B的含量可以作為癌癥病人的預后指標。研究發現，組織蛋白酶B是某些腫瘤細胞轉移的最關鍵的第一步-即水解細胞間基質的關鍵酶。組織蛋白酶B屬于半胱氨酸蛋白酶，在正常情況下位于溶酶體內，參與胞內蛋白質水解，為機體提供可循環使用的氨基酸。在腫瘤細胞中，組織蛋白酶B高表達，遷移到細胞表面和釋放到胞外，水解細胞間基質，啟動腫瘤細胞遷移。有研究表明，用組織蛋白酶B的抗體或組織蛋白酶B的抑制因子可以抑制腫瘤細胞的遷移。
許多藥物都是酶抑制因子，這些抑制因子可以分為競爭性抑制和非競爭性抑制因子，競爭性抑制因子直接占據酶活性中心，非競爭性抑制因子結合于酶的其它部位但會影響酶的催化活性。用蛋白酶抑制因子治療疾病最著名的例子是艾滋病治療。艾滋病毒需要將蛋白質前體剪切成有功能的各種蛋白質，參與病毒的復制，剪切蛋白質前體的是一種天冬氨酸蛋白酶，可以特異性地水解苯丙氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-脯氨酸之間的肽鍵，這是目前已知的人類蛋白酶所不能水解的肽鍵。當人們發明了該蛋白酶的抑制因子后，使艾滋病病人的死亡率降低了70％，成為艾滋病防治的最大新聞，使艾滋病治療有了希望。
蛋白酶抑制因子包括化合物和肽類抑制因子，生物體內的蛋白酶抑制因子(Proteinase Inhibitor，PI)是對蛋白酶有抑制活性的一類小分子蛋白質，屬于肽類抑制因子，普遍存在于動植物體內，它們能與蛋白酶的活性部位和變構部位結合，抑制酶的催化活性或阻止酶原轉化為有活性的酶。動物體內的蛋白酶抑制因子的功能是調節體內蛋白酶活性，從而控制體內蛋白水解平衡。許多農作物如大豆、小麥、玉米、番茄和馬鈴薯中都有高含量的蛋白酶抑制因子，一般儲存于種子和塊莖內，在某些植物的貯藏器官中，其含量占總蛋白的10％，是植物抵御害蟲嚙食和病原體侵染的主要分子。另外，植物葉片受到機械損傷或經化學物質處理后，也會產生大量蛋白酶抑制因子。目前已知的植物蛋白酶抑制因子可以分為十大類，許多具有抗癌功能的蔬菜和水果如谷物、馬鈴薯、南瓜等都含有蛋白酶抑制因子，與它們的抗癌功能有一定的關系。
大豆中已經報道的蛋白酶抑制因子屬于絲氨酸蛋白酶抑制因子。大豆(Glycine max)中的蛋白酶抑制因子主要存在于種子的子葉中，尤以子葉外側含量豐富，約占總蛋白的6％。大豆中的Kunitz胰蛋白酶抑制因子KTI，分子量為21,000道爾頓，由181個氨基酸殘基組成，含2個二硫鍵，活性中心在第63個氨基酸(精氨酸)和第64個氨基酸(異亮氨酸)之間。Kunitz胰蛋白酶抑制因子主要抑制胰蛋白酶，對糜蛋白酶只有微弱的抑制作用。該抑制因子的活性中心和胰蛋白酶結合非常緊密，形成不可逆復合物。大豆的Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子BBI，分子量為8,000道爾頓，由71個氨基酸殘基組成，含有7個二硫鍵，有2個不同的活性中心即第16個氨基酸(賴氨酸)和第17個氨基酸(絲氨酸)殘基之間及第43個氨基酸(亮氨酸)和第44個氨基酸(絲氨酸)殘基之間，分別與胰蛋白酶和糜蛋白酶結合。目前經檢索，未見從大豆中純化組織蛋白酶B抑制因子的研究報道，也沒有從大豆或豆粕中直接純化組織蛋白酶B抑制因子的技術的報道。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法。利用本發明的方法可以純化得到了一種分子量為10kDa的組織蛋白酶B抑制因子。
本發明涉及的從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，包括如下步驟(1)取大豆或豆粕研磨成粉，使其顆粒直徑為10μm～50μm，(2)溶入緩沖液中攪拌15小時～24小時，過濾去除沉淀，上清液經8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，50％硫酸銨沉淀，(3)將上述沉淀溶解在剛浸沒量的緩沖液中，于10倍體積的緩沖液中透析18小時～24小時，(4)透析后的溶液經8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，
(5)將步驟(4)的上清液緩慢加到用緩沖液平衡過的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分，(6)將所述收集液緩慢加到用緩沖液平衡過的離子交換柱上，先用200ml緩沖液洗滌柱子以去除未結合的蛋白質，再用100ml緩沖液對100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集，得到組織蛋白酶B抑制因子。
其中，所述豆粕是指提取大豆油后的殘渣。
其中，所述緩沖液優選是10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl緩沖液或20mmol/L、pH7.5的磷酸緩沖液。
其中，步驟(2)或(4)所述離心條件優選是10,000rpm離心10min。
其中，步驟(5)所述排阻層析柱優選是Sephadex G-75或Superdex排阻層析柱。
其中，步驟(6)所述離子交換柱優選是DEAE-Toyopearl或CM-Sepharose離子交換柱。
其中，步驟(4)透析后的溶液還可以先經蛋白酶或無機酸水解處理后，再進行下續步驟。
其中，上述的無機酸優選是鹽酸。
其中，所述步驟(5)或(6)的順序可以前后交換。
其中，依據步驟(1)至(6)的方法還可以得到組織蛋白酶L、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶的抑制因子。
利用本發明的方法純化得到組織蛋白酶B抑制因子，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測分子量為10kDa，從100克大豆或豆粕中可以純化到5mg～10mg組織蛋白酶B抑制因子。用蛋白酶或無機酸水解后的純化產物分子量小于10kDa。
下面結合實驗，對利用本發明的方法純化得到組織蛋白酶B抑制因子的藥理作用作進一步的說明。
組織蛋白酶B抑制因子的活性檢測方法方法(1)取50μl待檢測的抑制因子樣品，加入10U組織蛋白酶B，加6μl乙酸buffer(0.1mol/L，pH3.6)調節pH成酸性，37℃溫育15min，加入200μl 1％牛血紅蛋白(0.1mol/L乙酸buffer，pH3.6)做底物，37℃溫育1h，加入0.5ml 5％TCA終止反應，10,000rpm離心10min，取200μl上清液加入250μl 1mol/L NaOH，加2ml C液(2％NaCO30.5％酒石酸鈉鉀0.5％無水硫酸銅50∶0.5∶0.5)， 加200μl福林酚，混勻后靜置10分鐘，檢測750nm光吸收值。對照同樣處理，但用等量的Tris-HCl緩沖液替代抑制因子樣品(Zhao et al，2002)。
方法(2)用合成的熒光底物Z-Arg-Arg-AMC或Z-Phe-Arg-AMC檢測抑制因子對組織蛋白酶B活性的影響。100μl醋酸鈉緩沖液(100mM，pH4.5或其它適合的pH含0.05％Brij-35，1mM EDTA and 1mM cysteine)，加入Z-Arg-Arg-AMC或Z-Phe-Arg-AMC至終濃度為0.1mM/l或其它合適的濃度。將10U組織蛋白酶B與待監測的抑制因子混合，用熒光微孔板測讀儀在25度用355nm波長激發光和460nm波長發射光檢測，每20秒一次，共30分鐘(Bown et al.，2004)。
組織蛋白酶B抑制因子的抗腫瘤活性鑒定人宮頸癌細胞(Hela)和神經膠質瘤細胞(glioma)，用含10％新生牛血清，pH7.0的DMEM培養液在37℃，5％CO2及飽和濕度的培養箱內培養。抑制因子用Tris-HCl緩沖液調整為0.25mg/ml，0.5mg/ml和1mg/ml三種濃度，無菌抽濾，每種細胞設置5個處理空白對照(為培養基和用等體積Tris-HCl緩沖液替代抑制因子)、正常細胞對照(用等體積Tris-HCl緩沖液替代抑制因子)、0.025mg/ml，0.05mg/ml和1mg/ml抑制因子，每種處理設6個重復。將貼壁生長的Hela細胞和神經膠質瘤細胞分別用0.25％胰蛋白酶消化至細胞收縮、細胞間出現空隙時，吸棄培養液，并用含血清的DMEM培養液終止消化，同時用吸管吹打使細胞懸起成單細胞懸液，調整細胞人宮頸癌細胞(Hela)和神經膠質瘤細胞(glioma)密度至104個/ml，以每孔100μl的量傳代于96孔板，次日，細胞生長至指數生長期，吸棄上清液，空白對照組、細胞對照組換10μl buffer A+90μl DMEM培養液，實驗組各孔先加90μl DMEM培養液，再分別加不同濃度抑制因子10μl，混勻，繼續培養24h后，各孔中加入5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)20μl，然后再培養4小時，棄去上清液，每孔加100μl DMSO，10分鐘后紫色沉淀溶解，用酶聯儀測定570nm波長下吸光度值，并以下式計算存活細胞百分數存活細胞百分率＝A實驗/A對照×100％。抑制試驗數據經統計分析，結果顯示大豆組織蛋白酶B抑制因子在0.025～0.1mg/ml終濃度時，對人宮頸癌細胞(Hela)和神經膠質瘤細胞(glioma)生長的抑制率分別達到6～25％和5～20％。
上述實驗證明大豆組織蛋白酶B抑制因子對人宮頸癌細胞(Hela)和神經膠質瘤細胞(glioma)生長有顯著抑制效果。因此，該抑制因子有可能進一步研究開發成為抗腫瘤藥物或腫瘤預防藥物或相關保健預防食品的可能。本發明的技術方法適合放大生產，利用大豆或制取大豆油后的副產品豆粕均可純化制備該抑制因子，為大豆產品精加工和原料的綜合利用提供了新的途徑。
具體實施例方式
實施例1取大豆或豆粕研磨成粉，溶入Tris-HCl緩沖液中(10mmol/L Tris-HCl pH7.5，或其它相同功能等緩沖液)中攪拌過夜，過濾去除沉淀，上清液經10,000rpm離心10min，50％硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量Tris-HCl緩沖液中，于10倍體積的Tris-HCl緩沖液中透析過夜。透析后的溶液經10,000rpm離心10min，將上清液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過的排阻層析柱上(Sephadex G-75，或其它功能相同的層析柱)用Tris-HCl緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。將收集液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過的離子交換柱上(如DEAE-Toyopearl、CM-Sepharose柱或其它功能相同的層析柱)，先用200ml Tris-HCl緩沖液洗滌柱子以去除未結合的蛋白質，再用100ml Tris-HCl緩沖液對100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。用此技術獲得的產物，按前述活性檢測方法，檢測收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，SDS-PAGE檢測分子量為10kDa左右，對腫瘤細胞生長有顯著抑制作用，可以進一步開發成腫瘤治療藥物或腫瘤預防藥物。
實施例2將實施例1中的緩沖液換成pH7.5的磷酸緩沖液(或其它合適的緩沖液)，從大豆或豆粕中純化組織蛋白酶B抑制因子及獲得的產物。詳細技術取大豆或豆粕研磨成粉，溶入磷酸緩沖液中(20mmol/L pH7.5)，攪拌過夜，過濾去除沉淀，上清液經12,000rpm離心8min，50％硫酸銨沉淀，沉淀溶解在剛浸沒量的磷酸緩沖液中，于10倍體積的磷酸緩沖液中透析22小時。透析后的溶液經10,000rpm離心13min，將上清液緩慢加到用磷酸緩沖液平衡過的排阻層析柱上(Sephadex G-75)，用磷酸緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。再將收集液緩慢加到磷酸緩沖液平衡過的離子交換柱上(DEAE-Toyopearl)，先用200ml磷酸緩沖液洗滌柱子以去除未結合的蛋白質，再用100ml緩沖液對100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。用此技術獲得的產物，按前述活性檢測方法，檢測收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，SDS-PAGE檢測分子量為10kDa左右，對腫瘤細胞生長有顯著抑制作用，可以進一步開發成腫瘤治療藥物。
實施例3將實施例1和2中的層析柱換成其它功能相同的層析柱，從大豆或豆粕中純化組織蛋白酶B抑制因子及獲得的產物。詳細技術取大豆或豆粕研磨成粉，溶入Tris-HCl緩沖液中(10mmol/L Tris-HCl pH7.5)，攪拌過夜，過濾去除沉淀，上清液經10,000rpm離心10min，50％硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量Tris-HCl緩沖液中，于10倍體積的Tris-HCl緩沖液中透析過夜。透析后的溶液經10,000rpm離心10min，將上清液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過的排阻層析柱上(Superdex)用Tris-HCl緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。將收集液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過的離子交換柱上(DEAE-Sepharose)，先用200ml Tris-HCl緩沖液洗滌柱子以去除未結合的蛋白質，再用100ml Tris-HCl緩沖液對100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。用此技術獲得的產物，按前述活性檢測方法，檢測收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，分子量為10kDa左右，對腫瘤細胞生長有顯著抑制作用，可以進一步開發成腫瘤治療藥物。
實施例4在實施例1、2、3的基礎上，改變層析柱的順序，從大豆或豆粕中純化組織蛋白酶B抑制因子并獲得目的產物。取大豆或豆粕研磨成粉，溶入適當的緩沖液中，攪拌過夜，過濾去除沉淀，上清液經離心，硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量緩沖液中，于緩沖液中透析過夜。透析后的溶液經離心，將上清液緩慢加到用緩沖液平衡過的離子交換柱上，先用緩沖液洗滌柱子以去除未結合的蛋白質，再用緩沖液對NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。將收集液濃縮，緩慢加到用緩沖液平衡過的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。用此技術獲得的產物，按前述活性檢測方法，檢測收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，分子量為10kDa左右，對腫瘤細胞生長有顯著抑制作用，可以進一步開發成腫瘤治療藥物。
實施例5在實施例1、2、3、4的基礎上，先用蛋白酶或無機酸水解大豆或豆粕，再純化組織蛋白酶B抑制因子并獲得目的產物。取大豆或豆粕研磨成粉，溶入適當的緩沖液中，攪拌過夜，過濾去除沉淀，上清液經離心，硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量緩沖液中，于緩沖液中透析過夜。透析后的上清液經胰蛋白酶水解或鹽酸水解后，加到用緩沖液平衡過的離子交換柱上，先用緩沖液洗滌柱子以去除未結合的蛋白質，再用緩沖液對NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。將收集液濃縮，緩慢加到用緩沖液平衡過的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。用此技術獲得的產物，按前述活性檢測方法，檢測收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，分子量為10kDa或小于10kDa，對腫瘤細胞生長有顯著抑制作用，可以進一步開發成腫瘤治療藥物。
權利要求
1.一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，包括如下步驟(1)取大豆或豆粕研磨成粉，使其顆粒直徑為10μm～50μm，(2)溶入緩沖液中攪拌15小時～24小時，過濾去除沉淀，上清液經8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，50％硫酸銨沉淀，(3)將上述沉淀溶解在剛浸沒量的緩沖液中，于10倍體積的緩沖液中透析18小時～24小時，(4)透析后的溶液經8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，(5)將步驟(4)的上清液緩慢加到用緩沖液平衡過的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分，(6)將所述收集液緩慢加到用緩沖液平衡過的離子交換柱上，先用200ml緩沖液洗滌柱子以去除未結合的蛋白質，再用100ml緩沖液對100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集，得到組織蛋白酶B抑制因子。
2.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述豆粕是指提取大豆油后的殘渣。
3.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述緩沖液是10mmol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖液或20mmol/L、pH 7.5的磷酸緩沖液。
4.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(2)或(4)所述離心條件是10,000rpm離心10min。
5.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(5)所述排阻層析柱是Sephadex G-75或Superdex排阻層析柱。
6.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(6)所述離子交換柱是DEAE-Toyopearl或CM-Sepharose離子交換柱。
7.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(4)透析后的溶液還可以先經蛋白酶或無機酸水解處理后，再進行下續步驟。
8.如權利要求7所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述的無機酸是鹽酸。
9.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述步驟(5)或(6)的順序可以前后交換。
10.如權利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，依據步驟(1)至(6)的方法還可以得到組織蛋白酶L、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶的抑制因子。
全文摘要
本發明公開了一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子－組織蛋白酶B抑制因子的方法，包括大豆或豆粕研磨、攪拌、沉淀、透析、排阻層析柱、離子交換柱分離、洗脫、分部收集等步驟；利用本發明的方法純化制備的大豆組織蛋白酶B抑制因子對人宮頸癌細胞(Hela)和神經膠質瘤細胞(glioma)生長有顯著抑制效果，為一步研究開發成為抗腫瘤藥物或腫瘤預防藥物或相關保健預防食品以及大豆產品精加工和原料的綜合利用提供了新的途徑。
文檔編號A61P35/00GK1682903SQ20051004253
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月3日 優先權日2005年3月3日
發明者趙小凡, 王金星 申請人:山東大學