專利名稱：多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1在制備預防及治療帕金森病藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)的新用途，具體涉及一種多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)在制備預防及治療帕金森病藥物中的應用，屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種較為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，多發(fā)于中老年人，具有高發(fā)病率和高致殘率的特點。該病以隨意運動減少、肌僵直、肢體震顫和姿勢平衡障礙為主要臨床癥狀；以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進行性變性使紋狀體中多巴胺(DA)含量減少，并伴有Lewy小體生成為主要病理特征。據(jù)“九五”調(diào)查資料顯示，約有50%的病·人從未因H)癥狀到醫(yī)院就醫(yī)，因此實際患病人數(shù)可能遠遠超出統(tǒng)計數(shù)字。由于ro病程可長達十幾到幾十年，治療效果差和費用昂貴，因此給社會和家庭帶來沉重的負擔，對該病的研究是老年醫(yī)學的重要課題。PD的發(fā)病機制尚未完全清楚，目前臨床最為有效的方法是采用左旋多巴替代治療，但仍不能有效阻止或減緩疾病的發(fā)展，提示單純補充DA治療的局限性。因此需要從ro多個發(fā)病機制中尋找治療的新途徑和突破口。氧化應激、線粒體損傷以及由此而產(chǎn)生的多種功能蛋白的錯誤折疊和炎性因子的增多等是公認的重要致病機制，細胞內(nèi)游離鐵的增多可加劇氧化應激的發(fā)生。那么如何能找到抗氧化應激、抗炎及清除多余游離鐵的制劑是近幾年關注的焦點。近年來，多聚胞卩密唳結(jié)合蛋白I (poly C binding protein I, PCBPl ；或heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a -complex protein1，a CPI)的研究進展為我們這項發(fā)明的提出提供了契機。PCBPl功能多樣，在哺乳動物細胞內(nèi)廣泛表達，包括中腦黑質(zhì)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞。本研究率先展開直接將PCBPl在人源多巴胺能神經(jīng)細胞中過表達，再使細胞接受氧化應激毒素6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-0HDA)的作用，觀察PCBPl可能存在的對受損細胞的保護作用；確定PCBPl對受損細胞的保護效果后，以腺相關病毒為載體，將PCBPl重組腺相關病毒注入大鼠單側(cè)紋狀體，待其表達后，再將6-0HDA按相同部位注入大鼠雙側(cè)紋狀體，設立對照組，于不同時間觀察對照組，6-0HDA注射組(H)模型組)以及PCBP1+6-0HDA注射組(H)預防治療組)大鼠的行為學變化，以反映PCBP I對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用以及對神經(jīng)毒素6-0HDA的抗性作用。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析(I)PD發(fā)病機制的復雜性及其治療措施的研究現(xiàn)狀WHO 2001年的全球人口比例調(diào)查預測報告中指出，全球從2010年開始逐漸步入老齡化社會，而我國老齡化人口比例的增加要高于其它國家。因此威脅老年人的多種疾病也隨之日益受到關注。ro好發(fā)于中老年人，40歲前發(fā)病非常少見，提示神經(jīng)系統(tǒng)老化和細胞凋亡與之有關。已有研究表明ro與遺傳因素、環(huán)境因素、興奮性毒性、氧化應激、免疫學異常等諸多因素有關。因其發(fā)病機制復雜，所以至今難以產(chǎn)生明確的治療手段和方法。Mandel 等人在甲基苯基四氫批P定(l-methyl-4-phenyl-l，2, 3, 6-tetrahydro-pyridine, MPTP)和6-0HDA的H)動物模型上均得出氧化應激的產(chǎn)生、鐵活性的增強、畸變的蛋白折疊和聚集，炎癥反應，內(nèi)源性抗氧化劑的減少等是黑質(zhì)神經(jīng)元變性死亡的原因。蛋白質(zhì)的錯誤折疊與聚合、氧化應激過度和線粒體功能喪失普遍被認為是H)疾病機制中的重要組成部分。目前多種疾病如阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓病(HD)以及朊蛋白病(PrD)和H)的病變細胞中都具有一個共同的特征，即在遺傳性或獲得性的原因作用下，胞內(nèi)蓄積有大量錯誤折疊并易于聚合的蛋白質(zhì)，因此派生了神經(jīng)變性構(gòu)象病的新概念。但迄今為止，還沒有基于蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)換和聚合以及細胞的反應機制而設計的臨床治療措施應用于神經(jīng)變性疾病。已用于實驗的藥物包括化學藥品、分子伴侶、小分子多肽、單克隆抗體等，這些可減少蛋白錯誤折疊和聚集的措施一旦可以應用于臨床，將具有根治性的意義。過度的氧化應激是ro患者黑質(zhì)神經(jīng)元變性死亡的另一主因。有研究發(fā)現(xiàn)，在6-0HDA對大鼠造模后，7天后黑質(zhì)內(nèi)的游離鐵發(fā)生聚集，7-10天急劇增多，并且H)病人黑質(zhì)部位鐵離子和脂質(zhì)過氧化物(LPO)濃度明·顯增高，鐵離子約增高50%，鐵蛋白和谷胱甘肽(GSH,自由基清除系統(tǒng)成分)含量降低，GSH約降低50%。由于鐵離子濃度增高，當GSH含量明顯降低時，不能有效清除過氧化氫(H2O2),在高濃度鐵離子存在的條件下，H2O2便生成更具有毒性的0H+，進而產(chǎn)生LP0，使細胞變性死亡。所以目前認為鐵是氧化應激的可能觸發(fā)點，從而引起神經(jīng)退行性變，導致帕金森病的發(fā)生。但也有實驗研究顯示對照和H)組的黑質(zhì)中鐵的總量沒有顯著性差異，也就是說氧化應激的觸發(fā)者不是黑質(zhì)細胞中的總鐵量的多少，而是與鐵蛋白沒有結(jié)合的游離鐵的增多。細胞內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)失衡，比如鐵蛋白功能失調(diào)，游離鐵過多釋出，或者游離鐵的轉(zhuǎn)運機制失控，致使氧化應激加劇，均為帕金森病人腦衰老的可能機制。那么在治療上，主要包括可改善癥狀、阻止疾病進一步發(fā)展和神經(jīng)修復的藥物。目前改善癥狀的化學藥物往往帶來許多副作用，如左旋多巴(L-D0PA)。而尋找可阻止疾病進一步發(fā)展和神經(jīng)修復的藥物，如從抗氧化應激，采用螯合劑清除鐵，抗炎，讓蛋白重新正確折疊，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophicfactor, BDNF)等方面尋找藥物或適合的治療措施才能逐步從根本上治療H)。(2) PCBPl生物學功能的研究進展及其治療ro的可能性PCBPl的研究進展為我們研究帕金森病的治療措施提供了新的思路。PCBPl是一個在細胞內(nèi)具有多種功能角色的橋梁蛋白質(zhì)，在九十年代中期始有文獻報導，之后不斷發(fā)現(xiàn)其新的功能。它的染色體基因位點在2pl2-13,屬于核不均一核糖核蛋白(heterogeneousnuclear ribonuclear protein, hnRNPs)的一個亞家族，該亞家族有三個hnRNP K同源(hnRNP-K-homology，KH)域。PCBP I可通過KH域與mRNA靶分子的嘧啶富含區(qū)或某些蛋白質(zhì)結(jié)合，參與許多生物學過程，如復制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控，前mRNAs的加工成熟，mRNAs從核內(nèi)的運出，以及某些蛋白的翻譯控制。即KH類蛋白在胞內(nèi)廣泛的轉(zhuǎn)錄和翻譯事件中起著樞紐的作用，其KH域是調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組成成分，使這類蛋白可參與蛋白/核酸及蛋白/蛋白間的相互作用，為細胞的某些信號轉(zhuǎn)導事件提供了結(jié)構(gòu)基礎。有關PCBPl的研究內(nèi)容，經(jīng)目前檢索國內(nèi)文獻只有本課題組的一些報道。國外的研究已發(fā)現(xiàn)不同的組織細胞中，PCBPl發(fā)揮的功能并不相同。也就是說PCBPl可作為不同的mRNAs-蛋白復合體的成分，在不同的細胞中參與控制多種mRNA的翻譯和穩(wěn)定性，而且所調(diào)控的mRNA翻譯的蛋白往往是體現(xiàn)該組織細胞重要作用的大分子物質(zhì)。如對神經(jīng)組織的研究中發(fā)現(xiàn)PCBPl參與神經(jīng)纖維的發(fā)育，當脊椎動物的軸突發(fā)育成熟時，神經(jīng)絲-M(neurofilament, NF-M)表達增加，一定程度上歸因于NF-M mRNA的穩(wěn)定性，這是由于特定的結(jié)合蛋白結(jié)合到NF-M mRNA的3’_UTR區(qū)進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的結(jié)果，親和純化及質(zhì)譜分析鑒定特定的結(jié)合蛋白就是PCBPl和hnRNP K，它們識別并結(jié)合NF-M mRNA 3’ -UTRs的⑶-富含區(qū)，穩(wěn)定了 mRNA，伴隨軸突的成熟，增加了胞漿NF-M的水平。而NFs的調(diào)控紊亂與多種神經(jīng)系統(tǒng)的疾病發(fā)生相關。申請者多年來一直從事PCBPl在遺傳性疾病及神經(jīng)來源的細胞(如多巴胺能的神經(jīng)細胞系SH-SY5Y細胞)中的功能研究。同組研究人員發(fā)現(xiàn)細胞的早衰與PCBPl結(jié)合到核纖層有關，對早衰的細胞雙染發(fā)現(xiàn)PCBPl定位到了核膜內(nèi)，與核內(nèi)突變的核纖層蛋白發(fā)生相互作用并影響到了細胞核的形態(tài)而與早老綜合征的發(fā)病有關。通過酵母雙雜交研究發(fā)現(xiàn)PCBPl在蛋白-蛋白相互作用的層面更是參與多個功能環(huán)路，發(fā)揮了多種胞內(nèi)作用。如前所述，針對包括PD在內(nèi)的神經(jīng)變性構(gòu)象病的治療只是對癥治療，還沒出現(xiàn)有效抑制或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性構(gòu)象病患者腦內(nèi)蛋白聚集和沉淀的治療方法或藥物。但大量研究表明熱休克蛋白在蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集過程中起著重要作用。熱休克蛋白可以作為分子伴侶幫助錯誤折疊的蛋白質(zhì)恢復天然構(gòu)象或減少蛋白的錯誤折疊和聚集，還可把錯誤折疊的蛋白呈遞給蛋白酶體或溶酶體系統(tǒng)以促進它們的降解。因此，誘導熱休克蛋白表達是一類很有前途的可治療蛋白錯誤折疊疾病的方法。當Dong等人用腺病毒載體荷載的HSPAlA (產(chǎn)物:Hsp70)通過基因治療用于MPTP-損傷的H)鼠模型時，發(fā)現(xiàn)Hsp70的表達可顯著保護由MPTP損傷的神經(jīng)元，以及紋狀體多巴胺水平的下降，明顯緩解由安非它明誘導的單側(cè)帕金森鼠的偏側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。這些結(jié)果均提示分子伴侶Hsp70表達的增加有利于原發(fā)性PD的治療。而在我們近三年的研究工作發(fā)現(xiàn)PCBPl可調(diào)控熱休克蛋白70家族中HSPA6 (NM 002155)和HSPAlA (NM005345)的表達，過表達PCBPl可明顯上調(diào)Hsp70的表達。當在多巴胺能神經(jīng)細胞系SH-SY5Y細胞中過表達PCBPl時，HSPA6可上調(diào)15.87倍，HSPAlA可上調(diào)7.89倍。另一方面，在SH-SY5Y細胞中過表達PCBP1，通過基因芯片和熒光抗體染色技術(shù)，我們還發(fā)現(xiàn)了 PCBPl能夠上調(diào)BDNF的表達，BDNF的增加對多巴胺能神經(jīng)元損傷的修復具有很好的作用。而當對內(nèi)源性PCBPl基因敲低時，則發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)育和軸突形成等功能有關的多種基因均受到了影響。進一步的動物實驗也表明了 PCBPl對帕金森病模型的療效。我們研究結(jié)果已提示:如果將PCBPl用于帕金森病的基因治療可能會獲得更好的療效。另一些近期文獻報道提示了 PCBPl具有可能與ro治療相關的另外幾種生物學功能:一是抗炎；二是促細胞生長；三是可降低游離鐵的含量。目前已普遍發(fā)現(xiàn)6-0HDA所致的ro模型鼠腦中，大量炎性細胞因子如TNF-α，IL-6等的表達增加，可通過激活NF-κ B參與神經(jīng)元的變性死亡過程。同樣，2009年Aoki等對MPTP-損傷的PD小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，因凋亡所致的多巴胺能神經(jīng)元的喪失是由于多種細胞因子和凋亡相關蛋白在星形膠質(zhì)細胞中的增多，激活了 NF-kB通路所引發(fā)的，提示抑制NF-kB的活性會有利于H)及其它因凋亡和炎癥引起的神經(jīng)變性病的治療。同期Wang等人研究也發(fā)現(xiàn)在多巴胺能神經(jīng)細胞SH-SY5Y中，6-0HDA能夠抑制信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子3 (signal transducerand activator of transcription 3，STAT3)的活性，進而使 NF-κ B 活化，從而增加了炎性因子的表達，促進了神經(jīng)元的死亡，提示STAT3也可以作為治療PD的潛在藥物靶點。而在2007年，Nishinakamura等人已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)PCBPl能夠與組成性激活的STAT3(constitutivelyactivated STAT3, STAT3C)相互作用，抑制NF-κ B的活性；并且過量表達的PCBPl可增強IL-10對IL-6 (前炎癥因子)的拮抗作用，而沉默PCBPl則使得這種拮抗作用減弱。提示PCBPl可參與STAT3介導的對NF-κ B活化通路的抑制作用[1°]，有利于細胞處于抗凋亡狀態(tài)。近期Waggoner等人發(fā)現(xiàn)PCBPl和PCBP2 (與PCBPl同源性較強，均屬于KH類蛋白)在細胞周期進展中處于中樞地位，如果從K562細胞中敲除這兩個基因，則細胞增殖受阻，細胞周期被阻滯在Gl期。表明PCBPl的表達有利于細胞周期及細胞生長的進行。我們前期的工作中也得出了同樣的結(jié)論。此外，2008年末Science上的一篇文獻報導PCBPl可作為鐵的分子伴侶，將胞漿中的游離鐵(二價/三價)轉(zhuǎn)運到鐵蛋白中儲存起來，在一定的條件下再釋放結(jié)合的鐵，從而滿足胞漿中對鐵的需求。前已述及，胞漿中的游離鐵的增多是氧化應激的觸發(fā)點，從而可引起神經(jīng)退行性變，與ro的發(fā)病過程有密切的聯(lián)系。我們可以假設，即使細胞內(nèi)總鐵含量沒有改變，但是儲鐵的鐵蛋白在毒素的作用下如果發(fā)生了功能失調(diào)或錯誤折疊，就會致使過量的鐵被釋放出來，從而激發(fā)氧化應激，導致細胞受損。綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)PCBPl在諸多方面可以發(fā)揮對細胞的修復作用。設想如果能將PCBPi用于ro的治療，可能會是一個較為完美的生物調(diào)控分子

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供多`聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備預防或治療帕金森病藥物中的應用。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本發(fā)明的目的之二在于提供多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達藥物中的應用。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本發(fā)明的目的之三在于提供多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備促進人源多巴胺能神經(jīng)細胞的生長藥物中的應用。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:
(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本發(fā)明的目的之四在于提供多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備抑制由H)毒性物6-0HDA導致的神經(jīng)細胞的損傷藥物中的應用。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本發(fā)明經(jīng)過建立帕金森病細胞模型，發(fā)現(xiàn)外源導入的PCBPl能促進人源多巴胺能神經(jīng)細胞(SH-SY5Y細胞)的生長，同時，外源PCBPl具有抑制H)毒性物6-0HDA導致的神經(jīng)細胞的損傷的作用；共聚焦分析表明，PCBPl可以提高H)模型細胞中BDNF的表達水平，而BDNF是已知可以促進神經(jīng)元生長和活性的分泌因子。另外，在帕金森病動物模型上，預先注入PCBPl對疾病動物模型的行為改善作用進一步體現(xiàn)了該蛋白多肽的預防及抵抗帕金森病作用。因此，PCBPl這種多靶點的蛋白多肽或結(jié)構(gòu)與其類似的蛋白多肽可有望開發(fā)為抗ro作用的多肽生物制劑，本發(fā)明在臨床應用中具有重要價值和應用前景。



圖1為PCBPl-pEGFP-N2重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；圖2為PCBPl轉(zhuǎn)染后細胞生長情況；A為對照(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)，B為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組。C為兩組細胞相對數(shù)量與生長天數(shù)的關系圖3 為 5-100 μ mo I/L 6-0HDA 對 SH-SY5Y 細胞的損傷；圖4為加入G418后7_10天，鏡下觀察細胞克隆的形成；圖5為轉(zhuǎn)染PCBPl重組質(zhì)粒對6-0HDA損傷細胞的保護作用；圖6為轉(zhuǎn)染PCBPl重組質(zhì)粒后BDNF的表達情況；圖A、C顯示的是B、C細胞對應的核染色，紅色是BDNF的熒光抗體著色；圖B是對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細胞，圖D是PCBPl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞；圖7為psNAVl.0-PCBPl重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果；psNAV-PCBPl重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I和Bgl II酶切后的產(chǎn)物電泳，包括兩個條帶:
8.5kb左右的線性質(zhì)粒，Ikb左右的PCBPl圖8為對照組和空病毒注射組第一周行為學測試結(jié)果；圖9為對照組和空病毒注射組第二周行為學測試結(jié)果；圖10為對照組和空病毒注射組第三周行為學測試結(jié)果；圖11為對照組和空病毒注射組第四周行為學測試結(jié)果；圖12為對照組和空病毒注射組第五周行為學測試結(jié)果；圖13為模型組與病毒治療鼠第一周行為學測試結(jié)果；
模型組為單側(cè)注射空病毒+雙側(cè)注射6-0HDA組；病毒治療組為單側(cè)注射PCBPl重組腺相關病毒+雙側(cè)注射6-0HDA組；圖14為模型組與病毒治療鼠第二周行為學測試結(jié)果；圖15為模型組與病毒治療鼠第三周行為學測試結(jié)果；圖16為模型組與病毒治療鼠第四周行為學測試結(jié)果；圖17為模型組與病毒治療鼠第五周行為學測試結(jié)果；圖18為模型組與病毒治療鼠第六周行為學測試結(jié)果。
具體實施例方式下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1PCBPl在預防或抗帕金森病中的應用1材料SH-SY5Y細胞，購自美國標準生物品收藏中心(ATCC，CRL-2266);包含hnRNPEl序列的重組質(zhì)粒PCBPl-pcDNA 4/His C (我室構(gòu)建保存)；質(zhì)粒pEGFP_N2 (GeneBankAccession#:U57608)購自 Invitrogen 公司;人源 PCBP IcDNA 的開放閱讀框(ORF) (nt292-1362) (GenBank accession#genbank:NM 006196)經(jīng)克隆重組形成 PCBPl_pEGFP_N2 表達載體，PCBP1-ORF具體序列如序列表SEQ ID N0.1所示。所用試劑:TRIZ0L試劑購自 Invitrogen 公司；轉(zhuǎn)染試劑:lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；PCR反應試劑及內(nèi)切酶購自TaKaRa ;各種細胞培養(yǎng)基購自Gibicol公司；抗體包括PCBPl及BDNF —抗及其相應的熒光二抗和核染料Hoechst 33258購自Santa Cruz 或 Sigma0 腺相關病毒載體pSNAVl.0購自本元正陽，引物由上海生工合成。行為學測試采用TRUSCAN動物活動檢測系統(tǒng)(美國C0ULB0URN INSTRUMENTS)。其余試劑也均為進口或國產(chǎn)聞質(zhì)量廣品。2實驗方法2.1重組質(zhì)粒的表達和構(gòu)建首先，采用PCR從重組質(zhì)粒PCBPl-pcDNA 4/His C上擴增目的序列；引物包含限制性的酶切位點EcoR I。便于插入pcDNA 4/His C載體。PCBPl的ORF (SEQ IDN0.1所示)用下面的寡核苷酸引物來擴增:上游引物:5，TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG3，；下游引物:5’TTCTAGAATTC AACCTACACTGTTCTAGCTGCACC 3，。PCR 反應混合物包括 2.5μ I IOXPfu 反應緩沖液，2.0 μ I IOmM dNTPs, 1.5μ I25mMMg2+，0.5μ I 引物(50ng/μ I)混合物，2.5 μ I 模板 DNA，0.25 μ I Pfu 聚合酶(2.5U/μ I)，加水補足到25 μ I。PCR反應的程序為:95°C,4min ;之后行30個循環(huán)包括95°C lmin，52°C lmin, 72°C lmin ;最后72°C再延伸5min。多聚酶鏈反應片段產(chǎn)物用EcoR I消化并連接到pCDNATM4/His C載體上。陽性克隆通過酶切篩選，瓊脂糖凝膠電泳檢測以及測序鑒定。2.2SH-SY5Y細胞培養(yǎng)、神經(jīng)毒素6-0HDA的加入SH-SY5Y 細胞用含 15%FBS，1% 青 / 鏈霉素，IOmM HEPES 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基 37°C，5%C02常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液。將SH-SY5Y細胞按2 3X IO4個細胞/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，24h后，細胞密度需達到70 80%匯片，并將細胞培養(yǎng)上清液更換為沒有抗生素、無血清的培養(yǎng)基18h，再更換全培養(yǎng)基24h后分別加入不同劑量的6-OHDA，篩選其毒性劑量。2.3PCBP1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及PCBPl穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立轉(zhuǎn)染前一天，將SH-SY5Y細胞按3.5 4X IO6個細胞/瓶接種到T175培養(yǎng)瓶中，在轉(zhuǎn)染時，細胞密度需達到70 80%，并將細胞培養(yǎng)上清液更換為沒有抗生素的培養(yǎng)基。取
24μ g PCBP l-pEGFP-N2質(zhì)粒或pEGFP_N2與5ml opt1-MEM混勻，同時將72 μ I的脂質(zhì)體與5ml opt1-MEM混勻，室溫孵育5min后再分別將兩種質(zhì)粒混勻室溫放置20min。之后,將混合物加入細胞培養(yǎng)基中，輕輕晃動混勻。轉(zhuǎn)染8h后更換全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前先選擇出抗性藥物作用7-10天后，全部靶細胞死亡的G418的劑量。即空白目的細胞(SH-SY5Y)接種一個 12 孔板，按照 O, 200ng/ μ I，400ng/ μ I，600ng/ μ I，800ng/μ l,1000ng/y I的G418濃度梯度進行篩選，選擇7-10天剛好能殺死空白細胞的最低G418濃度。然后把PCBPl的表達載體(或空載體)轉(zhuǎn)染到靶細胞SH-SY5Y細胞后，加入選定劑量的抗性藥物G418。7-10天后，G418劑量減半，鏡下觀察細胞在培養(yǎng)瓶中會慢慢形成許多單克隆。繼續(xù)分別培養(yǎng)挑選出來的不同單克隆細胞，進行PCBPl基因表達的檢測。按PCBPl表達強度用預實驗確定濃度的6-0HDA (25 μ Μ)選擇相應克隆進行后續(xù)實驗。2.4rAAV2-PCBPl-EGFP 質(zhì)粒構(gòu)建為了成功轉(zhuǎn)染在體動物組織(實驗中指神經(jīng)系統(tǒng))，我們采用腺相關病毒載體psNAVl.0-EGFP構(gòu)建含PCBPl的重組表達載體，同樣，首先采用引物5’ -TTCTAGTCGACATG GAT GCC GGT GTG ACT GAA `AGTG 和 5，-TTCTA AGATCT CTAGCT GCA CCC CAT GCC 從PCBPl-pcDNA 4/His C上擴增含有腺相關病毒載體psNAVl.0-EGFP上插入酶切位點(Sal I和Bgl II)的PCBPl的序列，之后行PCR反應，反應程序同前。多聚酶鏈反應片段產(chǎn)物用Sal I和Bgl II酶切消化并連接到psNAVl.0-EGFP載體上。陽性克隆通過酶切篩選，瓊脂糖凝膠電泳檢測以及測序鑒定。2.5rAAV2-PCBPl-EGFP注射紋狀體對帕金森病大鼠的行為學效應檢測2.5.1動物模型的制備健康雄性成年SD大鼠60只，隨機分為三組，治療組25只，損傷組25只，對照組10只。治療組:左側(cè)紋狀體6-0HDA+PCBP1重組腺相關病毒，右側(cè)紋狀體6-0HDA ;損傷組:左側(cè)紋狀體6-0HDA+EGFP空病毒(其中10只僅注射空病毒，用來和對照組大鼠行為學比較)，右側(cè)紋狀體6-0HDA ;對照組:不做任何處理。操作過程:動物適應環(huán)境一周后，治療組左側(cè)紋狀體注射PCBPl重組病毒2X4 μ 1，損傷組左側(cè)紋狀體注射對照空病毒2X4 μ I (濃度均為2.5X 10nVg/ml)。定位參數(shù)以前囟和顱骨中線為參照。注射部位在前囟前1.0mm，SPAP=+1.0mm (囟后為負，囟前為正)，旁開3.0mm,即ML=+3.0mm (右為負，左為正)，硬腦膜下即DV=-4.5/5.5mm, I μ 1/min,留針5分鐘后慢慢退出。術(shù)后兩周兩組大鼠(治療組25只，損傷組15只)左右側(cè)紋狀體各注射24ug 6-0HDA/只注射。步驟:動物稱重，10%水合氯醛麻醉，0.33、.35ml/100g體重；將動物固定于立體定位儀上，用鑷子拉出舌頭，上牙齒掛好，插入耳桿，兩側(cè)耳桿坐標相等，夾緊鼻夾，調(diào)整齒桿-2.3mm(SD);用酒精濕潤毛發(fā)，剃刀剃去毛發(fā)，碘氟消毒皮膚；用力切開皮膚，約f 1.5cm長，用刀柄鈍性分離皮下組織，暴露顱骨，3%H202燒灼，直至看清囟門(前囟為十字縫，后囟為人字縫)；在囟門處用記號筆打一記號，調(diào)整立體定位儀，注射器針尖對準記號處，下降觸及顱骨，讀取橫縱坐標；根據(jù)紋狀體坐標AP=+1.0mm，ML=±3.0mm (右為負，左為正)調(diào)整坐標桿，用記號筆打記號；在記號處鉆孔，注射器留1μ I氣泡，然后抽藥，4 μ I 6-OHDA (6 μ g/μ I)，總量為24 μ g ;進針至硬腦膜下，讀取深度坐標，緩緩進針至紋狀體坐標處DV=-4.5/5.5mm,勻速進藥,I μ 1/min,留針5分鐘；緩慢上升針頭，沾少量生理鹽水濕潤切口，用生理鹽水浸泡明膠海綿，擠干后封孔，撒少量青霉素，縫合皮膚，腹腔注射青霉素(0.5ml/只)。一周后開始每周一次的行為學檢測，連續(xù)檢測5-6周。2.5.2行為學測試隨機取正常組和空病毒組大鼠各5只，病毒注射一周后開始檢測，每隔一周檢測一次，連續(xù)檢測5周，檢測過程盡量保證各批次檢測大鼠的生理活動狀態(tài)一致。另外，治療組與損傷組各取十只大鼠放入TRUSCAN箱中，實驗開始前確認箱內(nèi)是否清潔，徹底清理托盤上實驗留下的大鼠的糞便、尿液等)，在操作軟件中記錄大鼠的編號、日期，實驗動物提前運送到行為學實驗室專用臨時籠架，適應環(huán)境30min左右以減少動物緊張。將大鼠從籠內(nèi)取出(背向?qū)嶒炚?放置在箱內(nèi)，迅速、輕柔關閉箱體；打開錄像記錄系統(tǒng)，記錄大鼠在箱內(nèi)的活動，前15min適應時間記錄數(shù)據(jù)棄去不用，后30min實驗數(shù)據(jù)整理保存。實驗結(jié)束后將大鼠放回籠內(nèi)，流水沖洗托盤后用75%乙醇擦，并用紙巾擦干開始下一批動物實驗測試。檢測如下八個活動指標:DFP——平面監(jiān)測指標

活動注解:這些指標代表平面上的X-Y坐標改變,包括刻板樣活動。FP MOVES:FP_總活動，指在平面上的總活動情況。一次活動指在至少一個采樣間隔內(nèi)，坐標位置的一連串連續(xù)的改變，即沒有停頓(同一坐標)。FP MOVE ΜΕ:FP_總活動時間，在平面上的總活動的所有時間之和。(見移動時間)FP DISTANCE:FP_總活動距離，平面上所有坐標改變向量的總和。(見移動距離)FP AVG DIST/MVT:FP_單次活動平均距離，總活動距離除以該間期內(nèi)的活動次數(shù)。2) VP-垂肓面監(jiān)測指標VP_ENTRIES:VP-進入次數(shù)，動物身體的任一部分進入垂直面的總次數(shù)。VP ΜΕ:VP-時間，動物身體的任一部分處于垂直面內(nèi)的總時間。VP-MOVES:VP-總活動，垂直面內(nèi)的總活動。每次活動指的是，在至少一個采樣間隔內(nèi)，發(fā)生不停頓的(同一坐標)的一連串連續(xù)的坐標改變。VP DISTANCE:VP-總活動距離，在平面上的所有坐標矢量改變之和用GraphPadPrism 4軟件(GraphPad公司)進行統(tǒng)計分析，使用One way ANOVA方法統(tǒng)計，并作圖。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)土標準誤。結(jié)果1.PCBPl-pEGFP-N2 重組質(zhì)粒構(gòu)建:如圖1，第2、3泳道為EcoR I酶切鑒定的重組質(zhì)粒，泳道I為空載體。2.PCBPl重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞后的生長現(xiàn)象:如圖2所示(IOX)，將PCBPl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞中時，發(fā)現(xiàn)細胞加速生長，常規(guī)鋪板I X IO4個SH-SY5Y細胞/孔后，到第6天會發(fā)現(xiàn)細胞匯片達到95%以上，計數(shù)細胞均值為鋪板時的6.06倍(圖2A-6d)，而轉(zhuǎn)染了 PCBPl重組質(zhì)粒的SH-SY5Y細胞在第三天就達到了鋪板時的6.8倍(圖2B-3d)。3.5-100 μ mol/L6-0HDA損傷SH-SY5Y細胞的劑量:如圖3所示，實驗發(fā)現(xiàn)100 μ mo I/L 6-0HDA可致細胞第二天全部死亡，50 μ mo I/L 6-0HDA也使得95%以上細胞死亡，隨著6-0HDA劑量的下降，細胞存活的數(shù)量在增多，但5 μ mo I/L 6-0HDA仍顯示出一定的
毒性作用。4.克隆篩選:將PCBPl-pEGFP-N2重組質(zhì)粒或pEGFP_N2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞后，加入篩選藥物的G418后7-10天，如圖4所示，倒置熒光顯微鏡下可觀察到克隆形成。5.PCBPl對帕金森病細胞模型的保護作用:轉(zhuǎn)染PCBPl重組質(zhì)粒形成克隆，挑選培養(yǎng)鑒定后，血清饑餓18h后加入不同劑量6-0HDA，加入6-OHDA 24h后開始計數(shù)細胞(第一天)發(fā)現(xiàn)PCBPl對低于全死亡劑量的6-0HDA均有不同程度的抵抗作用，圖5中顯示的是
25μ M的6-0HDA損傷細胞后，轉(zhuǎn)染了 PCBPl重組質(zhì)粒的細胞生長速度顯著超過對照組，第6天達到高峰(ρ〈0.01)。6.增加BDNF的表達:我們發(fā)現(xiàn)PCBPl的表達增強可使腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的分泌`增多，體現(xiàn)在神經(jīng)元細胞內(nèi)的BDNF表達也會增加。如圖6D所示，轉(zhuǎn)染PCBPl會使BDNF的表達增加(與圖6Β比較，B, D所用熒光強度相同)，BDNF的增加會使神經(jīng)元的活性增強。7.pSNAVl.0-PCBPl重組質(zhì)粒酶切鑒定psNAV-PCBPl重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I和Bgl II酶切后的產(chǎn)物電泳，包括兩個條帶:
8.5kb左右的線性質(zhì)粒條帶以及Ikb左右的PCBPl片段條帶，psNAVl.0-PCBPl重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖7所示。8.行為學測試結(jié)果:對照組和空病毒注射組每周進行行為學測試結(jié)果均無統(tǒng)計學差異(圖8-圖12)，且大鼠每天不同時間段的自身行為活動能力的差異，另外，參測儀器需要在開啟后測完同一批所有的大鼠才能關閉，為縮短每周檢測的時間(每組大鼠檢測需要時間是60min)，保證檢測結(jié)果的可比性。故在觀察PCBPl腺相關病毒的療效時，選擇比較PCBPl重組腺相關病毒治療組和6-0HDA模型組間的差異。8.1正常組與空病毒組行為學比較(圖8-圖12):，實驗結(jié)果表明，正常組大鼠與空病毒注射組大鼠的行為學統(tǒng)計結(jié)果無差異。即空病毒對大鼠無效用，也就是病毒載體注入的大鼠組與對照組間無顯著差異，這樣可在排除病毒載體對大鼠不利影響的同時，進一步確實了該重組病毒抗帕金森病的效應是來自于PCBPl (條圖右側(cè)為治療組,每周8個條圖分別代表不同的測量參數(shù)，參見具體實施過程)。8.2病毒治療組與模型組行為學比較(圖13-18):PCBPl病毒組大鼠運動情況在各周均優(yōu)于模型組，其中以垂直方向的改善更為明顯(條圖右側(cè)為治療組，每周8個條圖分別代表不同的測量參數(shù)，參見具體實施過程)。因本實驗是PCBPl重組病毒注射先于神經(jīng)毒素6-0HDA的注射，因此認為，PCBPl某種程度上具有抗神經(jīng)毒素的損害或者說具有一定的預Kro的作用。結(jié)論:PCBP1可起到預防或抗帕金森病的作用。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本 發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備預防或治療帕金森病藥物中的應用。
2.按權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)將SEQID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
3.聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達藥物中的應用。
4.按權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)將SEQID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
5.聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備促進人源多巴胺能神經(jīng)細胞的生長藥物中的應用。
6.按權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)將SEQID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1 (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
7.聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備抑制由H)毒性物6-0HDA導致的神經(jīng)細胞的損傷藥物中的應用。
8.按權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未發(fā)生變化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)將SEQID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1(PCBP1)在制備預防及治療帕金森病(PD)藥物中的應用。本發(fā)明經(jīng)過建立帕金森病細胞模型，發(fā)現(xiàn)外源導入的PCBP1能促進人源多巴胺能神經(jīng)細胞(SH-SY5Y細胞)的生長，同時，外源PCBP1具有抑制PD毒性物6-OHDA導致的神經(jīng)細胞的損傷；共聚焦分析表明，PCBP1可以提高PD模型細胞中BDNF的表達水平。另外，在帕金森病動物模型上，預先注入PCBP1對疾病動物模型的行為改善作用進一步體現(xiàn)了該蛋白多肽的預防及抵抗帕金森病作用。因此，PCBP1這種多靶點的蛋白多肽或結(jié)構(gòu)與其類似的蛋白多肽可有望開發(fā)為抗PD作用的多肽生物制劑，在臨床應用中具有重要價值和應用前景。
文檔編號A61K38/17GK103083646SQ201210555379
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者霍麗蓉, 王曉民, 王蘭英, 梁建濤 申請人:首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院