專利名稱：與凋亡或壞死相關(guān)的TNFα短肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及引起細(xì)胞凋亡和壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動(dòng)劑多肽及其制法和用途。
背景技術(shù)：
TNF-a是一種多功能的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞分泌，其中最主要是來(lái)自巨噬細(xì)胞。TNF-a通過(guò)與靶細(xì)胞受體TNFR結(jié)合發(fā)揮多種生理功能，例如引起惡病質(zhì)、刺激淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死性死亡。TNF-a是以三聚體的形式與它的受體三聚體結(jié)合。然而，人們并不知道TNF-a與受體結(jié)合后為什么會(huì)引起以及如何引起不同的的功能，有時(shí)甚至是引起相反的功能。 有研究顯示，TNF-a在低pH環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上的變化，然后插入細(xì)胞膜，從而促使細(xì)胞發(fā)生裂解[Proc. Natl. Acad. Sci. 1996 ;USA 93:1021-1026]。這一結(jié)果提示TNF- a結(jié)構(gòu)的改變可能是它發(fā)揮功能的關(guān)鍵。此外，受體TNFR存在兩種形式，但是TNFR2受體只有存在于人體的某些細(xì)胞里，因此無(wú)法以此解釋為什么TNF-a與受體結(jié)合會(huì)引起的不同功能。這些未解之謎對(duì)TNF-a的臨床應(yīng)用造成了一定影響。因此，本領(lǐng)域迫切需要確定導(dǎo)致TNF-a不同功能的原因，并開發(fā)具有明確功能的TNF-a或其衍生多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種鑒定引起細(xì)胞凋亡和/或壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動(dòng)劑多肽的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述能引起細(xì)胞凋亡和/或壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動(dòng)劑多肽及其制法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種鑒別引起細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死的腫瘤壞死因子TNF-a激動(dòng)劑多肽的方法，包括步驟(a)提供基于腫瘤壞死因子TNF-a的多肽，所述多肽的長(zhǎng)度為7_50個(gè)氨基酸；(b)測(cè)定所述多肽引起細(xì)胞凋亡的能力和測(cè)試所述多肽引起細(xì)胞壞死的能力，如果所述多肽能夠明顯引起細(xì)胞凋亡且引起凋亡的程度遠(yuǎn)大于引起壞死的程度，則該多肽是引起細(xì)胞凋亡的TNF-a激動(dòng)劑多肽；如果所述多肽能夠明顯引起細(xì)胞壞死且引起壞死的程度遠(yuǎn)大于引起凋亡的程度，則該多肽是引起細(xì)胞壞死的TNF-a激動(dòng)劑多肽。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，如果所述多肽能夠明顯引起細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)caspase-3但沒有細(xì)胞膜破壞,而且這種(Caspase-3陽(yáng)性,細(xì)胞膜破壞陰性)細(xì)胞的百分比超過(guò)陰性對(duì)照中同樣細(xì)胞20%以上，則該多肽是引起早期細(xì)胞凋亡的TNF-a激動(dòng)劑多肽；如果所述多肽既能夠明顯引起細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)caspase-3又能引起細(xì)胞膜破壞，而且這種(Caspase-3陽(yáng)性，細(xì)胞膜破壞陽(yáng)性)細(xì)胞的百分比超過(guò)陰性對(duì)照中同樣細(xì)胞20%以上，則該多肽是引起晚期細(xì)胞凋亡的TNF-a激動(dòng)劑多肽；如果所述多肽不激活胞內(nèi)caspase-3的表達(dá)但卻能夠明顯引起細(xì)胞膜破壞，而且這種細(xì)胞(caspase-3陰性，細(xì)胞膜破壞陽(yáng)性)的百分比超過(guò)陰性對(duì)照中同樣細(xì)胞20%以上，則該多肽是引起細(xì)胞壞死的TNF-a激動(dòng)劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的陰性對(duì)照是在不添加所述的待測(cè)多肽的情況下，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的相同種類的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，當(dāng)該多肽滿足以下條件時(shí)，則該多肽是TNF-a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽⑴該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%，更佳地彡50%，最佳地彡70% )細(xì)胞表達(dá)caspase-3或發(fā)生凋亡；(ii)設(shè)Zl = Q1-Q2，則Zl彡20%，其中Ql為在相同條件下，該多肽引起的胞內(nèi)caspase-3表達(dá)(發(fā)生凋亡)的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q2為無(wú)多肽(或陰性多肽)引起胞內(nèi)表 達(dá)caspase-3的細(xì)胞百分比數(shù)量。較佳地，Zl彡30%，更佳地Zl彡50%;最佳地Zl彡70 %。在另一優(yōu)選例中，還包括根據(jù)以下條件，進(jìn)一步細(xì)分凋亡型激動(dòng)劑的類型(iii)設(shè)Z2 = Q3-Q4，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q4為無(wú)多肽(或陰性多肽)引起的細(xì)胞膜破壞數(shù)量(百分比)；當(dāng)21彡20%，Z2 ( 5%，判定為早期細(xì)胞凋亡；當(dāng)Zl彡20%, Z2彡20%，判定為晚期細(xì)胞凋亡。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，當(dāng)該多肽滿足以下條件時(shí)，則該多肽是TNF-a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽(i)在無(wú)caspase-3胞內(nèi)表達(dá)的條件下,該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%,更佳地> 50%，最佳地> 70% )細(xì)胞膜破壞(細(xì)胞壞死)；(ii)當(dāng)無(wú)細(xì)胞凋亡或Zl 5% (如0% )，設(shè)Z2 = Q3-Q4，則Z2彡20%，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q4為無(wú)多肽(或陰性多肽)引起的細(xì)胞細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量。(較佳地，Z2彡30%，更佳地Z2彡50% ；最佳地Z2彡70%。)在另一優(yōu)選例中，所述的多肽的序列來(lái)源于人TNF-a，更佳地來(lái)源于SEQ ID NO.I (或參見 uniprot/P01375)。在另一優(yōu)選例中，所述多肽的長(zhǎng)度為8-40個(gè)氨基酸，更佳地9-30個(gè)氨基酸，最佳地10-20個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種TNF-a的激動(dòng)劑多肽，所述的多肽具有以下特征(i)該多肽的序列來(lái)源于腫瘤壞死因子TNF-a的氨基酸序列；(ii)該多肽的長(zhǎng)度為7-50個(gè)氨基酸；(iii)該多肽具有明顯引起細(xì)胞凋亡或明顯引起細(xì)胞壞死的能力。在另一優(yōu)選例中，被誘導(dǎo)凋亡或被誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞、過(guò)度增長(zhǎng)的細(xì)胞包括與自身免疫相關(guān)的細(xì)胞(如自身免疫T細(xì)胞、B細(xì)胞)。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :3(P8)、6 (Pll)、7(P12)、8(P13)、15 (P20)和 16(P21)。
在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽包括？8、？11、？12、？13、？20、？21、P13-2、P13-3、P13-4、P13-5、P13—6、P13—7、P13—8、P13—9、P13—10、P16—6、P16—7、P16—8、P16-9、P16-10、P16-11 或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :9(P14)、10(P15)JP11(P16)。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽包括P14、P15、P16、P13-10、P14-1、P14-2、P14-3、P14-4、P16-5 或其組合。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體和本發(fā)明第二方面中所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第二方面中所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽的 用途，它被用于制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或壞死的藥物組合物。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第二方面中所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽的用途，它被用于制備治療腫瘤的藥物組合物；或用于制備治療自身免疫病及感染性疾病的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括口腔癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、結(jié)腸癌、肛門癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、壺腹癌、鼻咽癌、肺癌、皮膚癌(黑色素瘤)、骨癌、骨髓癌、T及B細(xì)胞淋巴瘤、白血病、何杰金氏瘤、非何杰金氏瘤、卡波氏肉瘤、頭頸部腫瘤、腦瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、胸腺癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、陰莖癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、輸卵管癌、陰道癌。在另一優(yōu)選例中，所述的感染性疾病包括HIV感染。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種體外(非治療性)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死的方法，包括步驟在本發(fā)明第二方面所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽存在下，培養(yǎng)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種誘導(dǎo)對(duì)象發(fā)生細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死的方法，包括步驟給需要治療的對(duì)象施用第二方面所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種減少或封閉對(duì)象發(fā)生TNF-a相關(guān)炎癥的方法，包括步驟給需要治療的對(duì)象施用第二方面所述的TNF- a的激動(dòng)劑多肽，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽(包括P12和P13)。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療感染性疾病的方法，其特征在于，包括步驟給需要治療的對(duì)象施用第二方面所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的感染性疾病是HIV感染。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽(包括P12和P13)。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種第二方面所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽的用途，它被用于制備提高體重的藥物組合物。在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種提高治療對(duì)象體重的方法，包括步驟給需要的對(duì)象施用第二方面所述的TNF-a的激動(dòng)劑多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象是腫瘤患者。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽是細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽(包括P12)、細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽(包括P16)、或其組合。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
累述。


圖Ia顯示了完整TNF-a不能誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡。圖Ib顯示了 TNF- a激活NF_kB (細(xì)胞生長(zhǎng))。·
圖Ic顯示了 TNF- a片段(多肽)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。圖Id顯示了各NF-多肽(20aa)誘導(dǎo)之細(xì)胞凋亡和壞死的圖譜。圖Ie顯示了 TNF-a (IOaa)多肽誘導(dǎo)之細(xì)胞凋亡和壞死的圖譜。圖If顯示了 TNF- a多肽誘導(dǎo)之新鮮或經(jīng)PHA刺激過(guò)的PBMC凋亡情況。圖Ig顯示了 TNF- a多肽誘導(dǎo)之新鮮或經(jīng)PHA刺激過(guò)的PBMC壞死情況。圖2顯示了 TNF- a結(jié)合可溶性的TNF受體。圖3a顯示了 P12和pl3抑制TNF-a的殺傷作用。圖313顯示了？12和？13可抑制丁,-0的殺傷作用。圖3c顯示了 Anti_P12抗體抑制TNF-a的殺傷作用。其中，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)為caspase-3表達(dá)量。空峰為陰性對(duì)照(就是無(wú)TNF- a，只有L929細(xì)胞)，因此無(wú)細(xì)胞凋亡(無(wú)caspase-3表達(dá))。TNF-a加L929細(xì)胞后會(huì)引起細(xì)胞凋亡。黑峰表示細(xì)胞表達(dá)caspase-3，細(xì)胞凋亡。右圖表明加對(duì)照血清對(duì)TNF-a殺L929細(xì)胞沒影響。左圖表示加了抗P12抗體后，抑制了 TNF-a引起的L929凋亡，黑峰左移，細(xì)胞凋亡減少。“I”和“2”是分別來(lái)源于兩只老鼠的抗血清。TNF-a的濃度是0. 59nM。圖4a顯示了 HIV感染導(dǎo)致MT2細(xì)胞死亡。圖4b顯示了 HIV感染導(dǎo)致MT2細(xì)胞死亡的曲線。圖4c顯示了 HIV感染或不感染的MT2細(xì)胞，在未經(jīng)P13或P16處理下細(xì)胞凋亡和壞死的情況。圖4d顯示了 HIV感染或不感染的MT2細(xì)胞，經(jīng)P13和P16處理后細(xì)胞凋亡和壞死的情況。圖4e用柱形圖總結(jié)圖4c的結(jié)果。圖4f用柱形圖總結(jié)圖4d的結(jié)果。圖4g顯示了隨著P13濃度的增加，HIV感染逐漸減少。圖4h顯示了使用P13和P16時(shí)，HIV感染細(xì)胞的數(shù)量圖。圖4i顯示了細(xì)胞凋亡激動(dòng)劑多肽P12和P13可以使上清液中的病毒含量減少。圖5顯示了 P16對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。圖6顯示了肽P12和P16對(duì)老鼠體重的影響。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了，完整的TNF-a可以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但是變性的TNF- a (如降低TNF- a溶液的pH值所導(dǎo)致的變性、酶降解所導(dǎo)致的變性)、片段化的TNF-a多肽卻能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或壞死。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于治療炎癥、感染和腫瘤具有極重要的應(yīng)用價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體地，完整的TNF- a能刺激一些正常的細(xì)胞(如PBMC)和其它許多細(xì)胞株的生長(zhǎng)(如Jurkat A3和MT2細(xì)胞)，但是很少會(huì)引起這些細(xì)胞的凋亡或壞死。完整的TNF-a也能引起一些腫瘤細(xì)胞(如L929和U937細(xì)胞)的死亡、凋亡及壞死。然而，一些TNF-a衍生多肽分別具有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死的功能。本發(fā)明不僅提供了定量鑒定細(xì)胞凋亡與壞死的方法(并以TNF-a為例子)，而且除TNF-a外，該方法還可以用于藥物(如小分子藥物及生物藥物)毒性的篩選。術(shù)語(yǔ)
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“TNF-a ”和“腫瘤壞死因子a ”可互換使用，指哺乳動(dòng)物(包括人)的腫瘤壞死因子a。優(yōu)選的TNF-a來(lái)源于人，野生型人TNF-a蛋白具有233個(gè)氨基酸，序列見 http://www. uniprot. org/uniprot/P01375 或 SEQ ID NO. :1。應(yīng)理解，該術(shù)語(yǔ)也包括天然存在的、上述野生型人TNF-a的突變體。本發(fā)明多肽在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的短肽”、“本發(fā)明的多肽”或“TNF-a衍生多肽”可互換使用，指衍生自TNF-a序列的、具有確定的引起細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死功能的多肽。通常，這些斷短肽的長(zhǎng)度為7-50個(gè)氨基酸，較佳地8-40個(gè)氨基酸，更佳地9-30個(gè)氨基酸，最佳地10-20個(gè)氨基酸。應(yīng)理解，本發(fā)明的短肽通常包括兩類多肽，即“TNF-a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽”和“TNF-a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽”。在本發(fā)明中，當(dāng)TNF-a及某一多肽滿足以下條件時(shí)，可認(rèn)為是TNF-a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽⑴該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%，更佳地彡50%，最佳地彡70% )細(xì)胞表達(dá)caspase-3或發(fā)生凋亡；(ii)設(shè)Zl = Q1-Q2，則Zl彡20%，其中Ql為在相同條件下，該多肽引起的胞內(nèi)caspase-3表達(dá)(發(fā)生凋亡)的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q2為無(wú)多肽(或陰性多肽)引起胞內(nèi)表達(dá)caspase-3的細(xì)胞百分比數(shù)量。較佳地，Zl彡30%，更佳地Zl彡50%;最佳地Zl彡70 %。此外，可進(jìn)一步基于(iii)進(jìn)行細(xì)分(iii)設(shè)Z2 = Q3-Q4，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q4為無(wú)多肽(或陰性多肽)引起的細(xì)胞膜破壞數(shù)量(百分比)。當(dāng)Zl彡20%，Z2 ( 5%，為早期細(xì)胞凋亡；當(dāng)Zl彡20%, Z2彡20%，為晚期細(xì)胞凋亡。在步驟(b)中，當(dāng)該多肽滿足以下條件時(shí)，則該多肽是TNF-a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽(i)在無(wú)caspase-3胞內(nèi)表達(dá)的條件下,該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%,更佳地> 50%，最佳地> 70% )細(xì)胞膜破壞(細(xì)胞壞死)；(ii)當(dāng)無(wú)細(xì)胞凋亡或Zl =彡5% (如0% )，設(shè)Z2 = Q3-Q4，則Z2彡20%，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q4為無(wú)多肽(或陰性多肽)引起的細(xì)胞細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量。則該多肽是引起細(xì)胞壞死的TNF-a激動(dòng)劑多肽。較佳地，Z2彡30%，更佳地Z2 ^ 50% ;最佳地Z2彡70%。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明“TNF-a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽”和“TNF_ a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽”的片段、衍生物和類似物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的“TNF- a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽”和“TNF- a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽”相同的生物學(xué)功能或活性(誘導(dǎo)凋亡或壞死)的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性 氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)該多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，還包括具有與上述“TNF-a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽”和“TNF_ a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽”相同功能的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-3個(gè)，較佳地1-2個(gè)，更佳地I個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為5個(gè)以內(nèi)，較佳地為3個(gè)以內(nèi)，更佳地為2個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。本發(fā)明多肽的變異形式包括同源序列和保守性變異體等。本發(fā)明還提供多肽的類似物。這些類似物與“TNF- a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽”和“TNF- a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多妝”的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“保守性變異多肽”指與相應(yīng)的“TNF- a的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽”和“TNF-a的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽”的氨基酸序列相比，有至多5個(gè)，較佳地至多3個(gè)，更佳地至多2個(gè)，最佳地至多I個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表A
最初的殘基I代表性的取代優(yōu)選的取代
Ala(A)Val；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn(N)Gln ；His ；Lys ；ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys (C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro ；AlaAla
His (H)Asn ；Gln ；Lys ；ArgArg
He (I)Leu ；Val ；Met ；Ala ；PheLeu
Leu (L)lie ；Val ；Met ；Ala ；Phelie
Lys(K)Arg ；Gln ；AsnArg
Met (M)Leu ；Phe ；IleLeu
Phe(F)Leu ；Val ；Ile ；Ala ；TyrLeu
Pro (P)AlaAla
Ser(S)ThrThr
Thr(T)SerSer
Trp (W)Tyr ；PheTyr
Tyr (Y)Trp ；Phe ；Thr ；SerPhe
權(quán)利要求
1.一種鑒別引起細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死的腫瘤壞死因子TNF-α激動(dòng)劑多肽的方法，其特征在于，包括步驟 (a)提供基于腫瘤壞死因子TNF-α的多肽，所述多肽的長(zhǎng)度為7_50個(gè)氨基酸； (b)測(cè)定所述多肽引起細(xì)胞凋亡的能力和測(cè)試所述多肽引起細(xì)胞壞死的能力，如果所述多肽能夠明顯引起細(xì)胞凋亡且引起凋亡的程度遠(yuǎn)大于引起壞死的程度，則該多肽是引起細(xì)胞凋亡的TNF-α激動(dòng)劑多肽；如果所述多肽能夠明顯引起細(xì)胞壞死且引起壞死的程度遠(yuǎn)大于引起凋亡的程度，則該多肽是引起細(xì)胞壞死的TNF-α激動(dòng)劑多肽。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，當(dāng)該多肽滿足以下條件時(shí)，則該多肽是TNF- α的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽 (i)該多肽可引起彡20% (較佳地彡30%，更佳地彡50%，最佳地彡70% )細(xì)胞表達(dá)caspase-3或發(fā)生凋亡； ( )設(shè)Zl = Q1-Q2，則Zl彡20 %，其中Ql為在相同條件下，該多肽引起的胞內(nèi)caspase-3表達(dá)(發(fā)生凋亡)的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q2為無(wú)多肽(或陰性多肽)引起胞內(nèi)表達(dá)caspase-3的細(xì)胞百分比數(shù)量。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，當(dāng)該多肽滿足以下條件時(shí)，則該多肽是TNF- α的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽 (i)在無(wú)caspase-3胞內(nèi)表達(dá)的條件下,該多肽可引起彡20%(較佳地彡30%,更佳地彡50%，最佳地彡70% )細(xì)胞膜破壞(細(xì)胞壞死)； (ii)當(dāng)無(wú)細(xì)胞凋亡或Zl5% (如0% )，設(shè)Z2 = Q3-Q4，則Z2彡20%，其中Q3為在相同條件下，該多肽引發(fā)的胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量，而Q4為無(wú)多肽(或陰性多肽)弓丨起的細(xì)胞細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞百分比數(shù)量。
4.一種TNF-α的激動(dòng)劑多肽，其特征在于，所述的多肽具有以下特征 (i)該多肽的序列來(lái)源于腫瘤壞死因子TNF-α的氨基酸序列； ( )該多肽的長(zhǎng)度為7-50個(gè)氨基酸； (iii)該多肽具有明顯引起細(xì)胞凋亡或明顯引起細(xì)胞壞死的能力。
5.如權(quán)利要求4所述的激動(dòng)劑多肽，其特征在于，所述的多肽是細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽； 更佳地，所述的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :3、6、7、8、15和16 ;或者所述的細(xì)胞凋亡型激動(dòng)劑多肽包括P8、P11、P12、P13、P20、P21、P13-2、P13-3、P13-4、P13-5、P13—6、P13—7、P13—8、P13—9、P13—10、P16—6、P16—7、P16—8、P16—9、P16-10、P16-11 或其組合。
6.如權(quán)利要求4所述的激動(dòng)劑多肽，其特征在于，所述的多肽是細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽； 更佳地，所述的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽含有或具有選自下組的序列SEQID NO. :9、10、和11 ;或者所述的細(xì)胞壞死型激動(dòng)劑多肽包括P 14、P15、P16、P13-10、P14-1、P14-2、P14-3、P14-4、P16-5 或其組合。
7.—種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體和如權(quán)利要求4所述的TNF-α的激動(dòng)劑多肽。
8.如權(quán)利要求4所述的TNF-α的激動(dòng)劑多肽的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或壞死的藥物組合物。
9.如權(quán)利要求4所述的TNF-α的激動(dòng)劑多肽的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤的藥物組合物；或用于制備治療自身免疫病及感染性疾病的藥物組合物。
10.一種體外(非治療性)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死的方法，其特征在于，在權(quán)利要求4所述的TNF- α的激動(dòng)劑多肽存在下，培養(yǎng)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞壞死。
全文摘要
本發(fā)明涉及與凋亡或壞死相關(guān)的TNF-α短肽及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了鑒定引起細(xì)胞凋亡和壞死的腫瘤壞死因子TNF-α激動(dòng)劑多肽的方法，以及用該方法鑒別出的多肽。本發(fā)明多肽具有明確的引起細(xì)胞凋亡和/或壞死的功能，因此可用于治療腫瘤、感染性疾病。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102776264SQ20111011785
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月7日
發(fā)明者姜石松 申請(qǐng)人:姜石松