專利名稱：長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種預防鸚鵡幼雛病毒病弱毒疫苗的制備方法。
鸚鵡幼雛病(又稱長尾小鸚鵡幼雛病毒病)是由長尾小鸚鵡幼雛病毒引起的一種高死亡率的急性傳染病，鸚鵡類鳥多易感。自90年代以來，在世界多個地區廣泛流行，嚴重地阻礙著鸚鵡養殖業及各種類籠養鳥的向前發展。湖北省云夢縣是全國最大的籠養鳥基地之一，94-96年間發生了前所未有的大規模鸚鵡幼雛死亡，死亡率超過80％；迅速波及其他鸚鵡養殖區及外省區域，造成了嚴重的經濟損失。
迄今，國內外尚無對鸚鵡幼雛病采用疫苗防治的相關研究報道。目前“查新”中未見有相關鸚鵡幼雛病疫苗的資料。近幾年來德國、美國進行了鸚鵡幼雛病毒分子結構的研究，對疫苗的開發具有潛在的意義。德國墨尼黑大學Müiller教授、美國的禽病學家在研究中發現BFDV-DNA對甲醛具有穩定性，對Ethylenimine(乙烯亞胺)敏感，而該試劑具有較強的致癌性；而且燃點為42℃，極不安全。
本發明的目的是提供一種長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗的制備方法，采用長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，用組織細胞培養方法生產長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，疫苗接種后可有效地預防長尾小鸚鵡幼雛病毒病。對鸚鵡的免疫保護率達到99．76％左右。
本發明所涉及長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，是由強毒型的長尾小鸚鵡幼雛病毒(Budgerigar Fledgling Disease Virus，BFDV)采用連續鸚鵡胚成纖維細胞適應性培養后，再轉接到雞胚成纖維細胞培養轉接30代以上得到的弱毒株，該弱毒株特有的重要生物活性是已喪失對其原宿主動物(鸚鵡)的致病力，保留了良好的免疫原性。長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，已于1999年12月8日交送保藏在中國典型培養物保藏中心，CCTCC NOV99006。
鸚鵡幼雛病毒弱毒株病毒的主要生物學特性鸚鵡幼雛病毒呈二十面體對稱球形顆粒，直徑約45-50納米，無囊膜，核酸是DNA類型；此病毒對熱、凍融和氯仿、乙醇、甲醛、乙醚等化學試劑具有穩定性；接種在雞胚成纖維細胞培養可引起細胞病變，細胞體腫脹變圓、細胞核腫大并出現拉網現象。對其原宿主動物(鸚鵡)的無致病力，有良好的免疫原性。
制備長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗的技術方案是將長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒按5％～10％接種于雞胚成纖維細胞，在37℃～39．5℃培養，收集48-72小時產生細胞病變的病毒液，采用0．9％ N．S作為稀釋液，按1∶10的比例稀釋，得到長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，可有效的預防鸚鵡幼雛病毒病的發生。該弱毒疫苗對鸚鵡的免疫保護率99．62-100％，平均為99．76％，對鸚鵡的的免疫保護期不低于8個月；該疫苗在低溫條件下有較長的保存期。
2．取長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒按5％接種雞胚成纖維細胞(單層)，置38℃培養(37～39℃均可)；24小時細胞出現病變，見細胞體腫脹變圓、細胞核腫大并出現拉網現象；收集48-72小時的病毒液(在此時間范圍內選擇細胞病變明顯的收集)。
3．采用免疫瓊脂擴散法檢測病毒液效價，以出現明顯免疫沉淀線為陽性。
4．按1∶10比例稀釋病毒液，即1∶0．9％N．S。
5．疫苗雜菌檢驗，合格后分裝冷藏。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果(1)免疫保護性強采用鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，0．2ml／只，接種鸚鵡，對照組用鸚鵡幼雛病毒野毒接種；將接種疫苗的鸚鵡在第14天攻毒(野毒)，觀察20～100天，接種疫苗的鸚鵡表現有較強的保護性，免受鸚鵡幼雛病毒野的侵襲；而接種鸚鵡幼雛病毒野毒的鸚鵡則無保護；疫苗對鸚鵡的免疫保護率為99．76％。結果見表一表一鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗免疫保護率檢測結果
結果表明鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗對鸚鵡的保護率為99．76％。
(2)安全性好采用健康鸚鵡15日齡以下幼雛，接種鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗0．2ml／只，飼養觀察100天。結果見表二表二鸚鵡幼雛病毒不同代弱毒株安全性試驗結果鸚鵡幼雛病毒弱毒株 只死亡 存活安全率％25代 125 8 117 93．630代 117 3 114 97．435代 156 1 155 99．040代 121 1 120 99．0*平均安全率為97．25％。
(3)免疫血清抗體測試采用長尾鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗接種15齡以下雛鸚鵡，分別在免疫后10、15、25、40、60、100天取血檢測，采用免疫瓊脂擴散法，血清稀釋按1∶100比例稀釋。結果見表三表三 鸚鵡幼雛病毒弱毒免疫血清抗體檢測結果天數 只免疫沉淀線1057 +-++1538 ++2535 ++4030 +-++6028 +100 46 +*鸚鵡幼雛病毒弱毒免疫血清抗體出現高峰在第10天-25天；其維持時間較長。
(4)疫苗保存期長4批疫苗(批號980906、981020、990115、990327)在-10～4℃可保存10個月左右。
(5)預防效果好用鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗(批號980906、981020、990115、990327)先后在湖北省云夢、孝感、應城三個地區，5個鸚鵡養殖場、10余家養殖戶使用。免疫免疫雛、青年和成年鸚鵡5260余對，接種后臨床觀察2-6個月，安全，免疫效果良好。
(6)采用本法明制備鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，生產工藝簡便，成本低。
權利要求
1．一種長尾小鸚鵡幼雛病毒病弱毒疫苗的制備方法，其特征是A．采用長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，保藏編號CCTCC NOV99006，制備雞胚成纖維細胞，采用9-10日齡雞胚，在無菌條件下取出胚體，勻漿，加入PH7．5的5％的胰蛋白酶消化液，混勻，置37℃水浴消化，取出離心棄消化液，裝在細胞培養瓶，加10％小牛血清，組織培養液，37℃培養16-18小時的細胞形成單層；B．取長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒5％接種雞胚成纖維細胞，置38℃培養，24小時出現細胞病變；C．收集培養48-72小時有細胞病變的病毒液；D．免疫瓊脂擴散法檢測其效價為陽性，按1∶10比例稀釋；E．雜菌檢驗合格后分裝冷藏。
全文摘要
本發明公開了一種預防鸚鵡幼雛病毒病弱毒疫苗的制備方法。其步驟是:將長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒液5～10%接種于雞胚成纖維細胞;在37℃～39.5℃培養溫度,收集48—72小時產生細胞病變的病毒液;采用0.9%N.S作為稀釋液,按1∶10的比例稀釋;進行雜菌檢驗,合格后分裝冷藏。疫苗對鸚鵡的免疫保護性強,保護率99.62—100%、安全性好、保存期長、生產工藝簡便,成本低;可有效的預防鸚鵡幼雛病毒病。
文檔編號A61K39/12GK1289621SQ00114489
公開日2001年4月4日 申請日期2000年4月17日 優先權日2000年4月17日
發明者李天憲, 陳繩亮, 馮峰, 夏韋, 趙林 申請人:中國科學院武漢病毒研究所